Modularization and optimization of enzymatic reactions applying whole cell biocatalysis in micro-aqueous solvent systems

Wachtmeister, Jochen; Rother, Dörte; Blank, Lars Mathias

doi:34953

Modularization and optimization of enzymatic reactions applying whole cell biocatalysis in micro-aqueous solvent systems = Modularisierung und Optimierung enzymatischer Reaktionen unter Anwendung von Ganzzellbiokatalyse in mikro-wässrigen Lösungsmittelsystemen

Wachtmeister, Jochen

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science Jochen Wachtmeister

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressolurce (XI, 155 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Rother, Dörte (Thesis advisor) ; Blank, Lars Mathias (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-04-05

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-037410
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/573792/files/573792.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/573792/files/573792.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Projekte

GRK 1166 - GRK 1166: Biokatalyse in unkonventionellen Medien - Ionische Flüssigkeiten, organische Lösungsmittel, überkritische Fluide und Gase als Reaktionsphasen für biokatalysierte Synthesen (811503) (811503)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; biocatalysis (frei) ; biotransformation (frei) ; enzyme cascade (frei) ; biotechnology (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das wachsende Verständnis enzymatischer Reaktionen und ihrer Nutzung für synthetische Zwecke führt zu steigenden Forschungsaktivitäten auf dem Gebiet künstlicher, biokatalytischer Mehrschrittreaktionen. Diese synthetischen Enzymkaskaden setzen kostengünstige Substrate zu wertvollen Substanzen verschiedenster Anwendungen um. Trotz ihres großen Potenzials, wird die Produktivität biokatalytischer Kaskadenreaktionen häufig als unzureichend für die Implementierung in industrielle Prozesse eingeschätzt. Diese Limitierung zu überwinden, und die Erforschung, Anwendung, Optimierung und Maßstabsvergrößerung biokatalytischer Kaskadenreaktionen zu vereinfachen, war Ziel dieser Arbeit. Als repräsentativer chiraler Baustein für pharmazeutische Synthesen wurde 1-Phenylpropan-1,2-diol als Modellprodukt gewählt. Die Produktion erfolgte durch die Kombination aufeinanderfolgender Carboligation und Oxidoreduktion.Um die ökonomische und ökologische Relevanz des Modelprozesses zu steigern, wurden lyophilisierte Ganzzellkatalysatoren in mikro-wässrigen Lösungsmitteln genutzt. Dadurch kann eine günstige und widerstandfähige Katalysatorformulierung eingesetzt werden, die unabhängig von einer teuren, externen Cofaktorzusetzung ist. Zudem ermöglicht die Reaktion in organischen Lösungsmitteln, neben vereinfachter Produktaufarbeitung durch direkte Lösungsmittelverdampfung, außergewöhnlich hohe Substrat- und Produkttiter.Zur einfachen Untersuchung und Anwendung von Kaskadenreaktion, war der vereinzelnde Einschluss von Ganzzellbiokatalysatoren vorgesehen, welcher die Verwendung als katalytisches Modul ermöglichen sollte. Dazu wurden Ganzzellkatalysatoren in eine Polymermembran eingeschlossen, welche als katalytischer Teebeutel diente. Der katalytisch aktive Teebeutel erwies sich als nützliches Werkzeug, welches (i) die vereinfachte Handhabbarkeit des Biokatalysators, (ii) eine unkomplizierte Katalysatorrückgewinnung und -rezyklierung, (iii) eine erleichterte Kaskadenoptimierung und einen einfachen Aufbau, sowie (iv) die präparative Produktion chiraler Substanzen ermöglicht. In einem zweiten Projektteil, wurde die Skalierbarkeit des Teebeutel-Konzeptes auf bis zu 150 mL demonstriert. Hier konnte exemplarisch die Produktion von (1R,2R)-1-Phenylpropan-1,2-diol im Grammmaßstab vereinfacht werden. Als geeignetes Reaktionsgefäß erwies sich nicht nur der Einsatz neuartiger Reaktorkonzepte wie der des SpinChem-Reaktors (Nordic ChemQuest AB) als nützlich, sondern auch die Nutzung ubiquitär verfügbarer Laborausstattung. In einem dritten Projektteil, wurde die Übertragbarkeit der untersuchten Konzepte auf zwei weitere Biokatalysatoren gezeigt. Dies ermöglichte den stereoselektiven Zugang zu allen vier Stereoisomeren des 1-Phenylpropan-1,2-diols mit industriell relevanten Produktkonzentrationen. Dazu wurde eine Kombination aus Reaktions- und Lösungsmittel-Optimierungen angewendet. Für zwei der finalen Kaskaden konnte durch Implementierung „smarter“ Co-Substrate bis zu 90 mol% des benötigten Co-Substrats eingespart werden. Gleichzeitig konnten hohe Produkt- und Raum-Zeit-Ausbeuten erreicht werden, die industrielle Anforderungen übertreffen. Zusätzlich wurde die Menge anfallenden Abfalls auf ein außergewöhnlich kleines Maß reduziert.Zusammengefasst vereinfachte das Teebeutelkonzept die Untersuchung synthetischer Enzymkaskaden. Das entwickelte Modul ist einfach herzustellen und auch für Nutzer, welche unerfahren in der Handhabung biologischer System sind, simpel einsetzbar. Das Modul kann zudem für die präparative Produktion chiraler Substanzen genutzt werden. Durch die Kombination aus Reaktions- und Lösungsmitteloptimierung konnten die Mindeststandards industrieller Anwendbarkeit deutlich übertroffen werden. Dies demonstriert das Potential synthetischer Enzymkaskaden auch über den Forschungsmaßstab hinaus.

Growing understanding of enzymatic reactions and their utilization for synthetic purposes has led to a rising interest in development of artificial, biocatalytic multi-step reactions. These synthetic enzyme cascades selectively convert inexpensive substrates into valuable compounds of varying applications. Despite their many advantages, the productivity of biocatalytic cascade reactions is oftentimes considered unsatisfactory for implementation into industrial scale processes. To overcome this limitation and facilitate investigation, application, optimization, and scale-up of biocatalytic cascade reactions was the objective of this thesis. Representing a valuable chiral building block for pharmaceutical synthesis, 1-phenylpropane-1,2-diol was chosen as a model product, accessed by subsequent carboligation and oxidoreduction.In order to increase the economic and ecologic relevance of the model process and of synthetic enzyme cascades in general, lyophilized whole cell catalyst was used in a micro-aqueous solvent system. In doing so, a cheap and stable catalyst formulation was employed, independent of costly external cofactor addition. The cofactor, supplied by the whole cell catalyst itself, was recycled by substrate-coupled regeneration. Furthermore, the reaction in organic solvent enabled outstandingly high substrate and product titers together with facilitated downstream processing by straightforward solvent evaporation.To enable an easy cascade investigation and setup, the compartmentalized entrapment or encapsulation of whole cell catalyst was envisaged, allowing to serve as a catalytic module. Therefore, whole cell catalyst was retained in a polymeric membrane, resulting in a catalytic teabag. The catalytic teabag was proven a useful modularization tool, enabling (i) simplified and flexible handling and combination of biocatalysts, (ii) straightforward catalyst recovery and recycling, (iii) facilitated cascade optimization and set-up, as well as (iv) small scale preparative production of chiral compounds. In a second project part, the teabag approach was demonstrated scalable up to 150 mL, facilitating the gram-scale manufacturing of (1R,2R)-1-phenylpropane-1,2-diol in a 1-pot 2-step cascade. As suitable reaction vessel, not only novel reactor concepts such as the SpinChem reactor (Nordic Chemquest AB) were proven useful, but also ubiquitously available lab equipment. In a third project part, the investigated concepts were demonstrated transferable to two more catalysts, now granting stereoselective access to all four diastereoisomers of 1-phenylpropane-1,2-diol at industrially relevant product concentrations. To achieve this goal, a combination of reaction engineering and solvent engineering was applied. By the implementation of “smart” diol co-substrates up to 90 mol% of co-substrate could be saved during oxidoreduction in two of the final cascades. At the same time, product yield and space-time-yields obtained met industrial benchmarks while outstandingly small amounts of waste were generated.In summary, the investigation of synthetic enzyme cascades was strongly facilitated by the teabag approach. The developed module is quickly manufactured and easily manageable, also by users unexperienced in handling of biological systems and can even be used for the preparative production of chiral compounds. The combination of solvent and reaction engineering allowed exceeding industrial threshold and thus illustrated the potential of synthetic enzyme cascades even beyond the investigatory scale.

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