Potential applications of laccase-mediator-systems for biorefinery purposes

Roth, Simon; Schwaneberg, Ulrich; Spieß, Antje

doi:34939

Potential applications of laccase-mediator-systems for biorefinery purposes = Anwendungsmöglichkeiten von Laccase-Mediator-Systemen für Bioraffinerie-Prozesse

Roth, Simon

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Simon Roth (M.Sc.) aus Mönchengladbach

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (XVI, 150 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Spieß, Antje (Thesis advisor) ; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-02-09

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-020710
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/571453/files/571453.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/571453/files/571453.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; laccase (frei) ; mediator (frei) ; lignin (frei) ; biorefinery (frei) ; lignocellulose (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Im Rahmen der dieser Promotionsschrift zugrunde liegenden Studie wurden mögliche Prozessanwendungen pilzlicher Laccasen in Kombination mit Redoxmediatoren (sog. Laccase-Mediator-Systeme, LMS) im Kontext einer modernen Bioraffinerie untersucht. Das Projekt wurde als Teil des Exzellenzclusters „Tailor-made Fuels from Biomass“ (TMFB) durchgeführt.Zeitgemäße Konzepte für Bioraffinerie-Prozesse streben die Nutzung lignocellulotischer Biomasse als Rohstoff zur Gewinnung von Treibstoffen und Plattformchemikalien an. Für die weitere Verwertung muss Lignocellulose jedoch zunächst energieaufwendig vorbehandelt und desintegriert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einsatz von Laccase-Mediator-Systemen für die Vorbehandlung von Biomasse erprobt. Es konnte gezeigt werden, dass die enzymatische Vorbehandlung von unbehandeltem Buchenholz mit LMS einen positiven Einfluss auf die nachfolgende enzymatische Hydrolyse der Cellulose hat. Dieser Effekt war jedoch nur zu beobachten, wenn die LMS-Vorbehandlung mit einer nachfolgenden Gefriertrocknung kombiniert wurde. So konnte eine Steigerung der Glucose-Ausbeuten um den Faktor 1,3 erzielt werden. Es ist davon auszugehen, dass die Gefriertrocknung der Lignocellulose zwar zu einer Auflockerung der Struktur der Biomasse und somit zu einer Vergrößerung der Oberfläche führt, damit aber auch mehr Lignin zugänglich wird, welches Cellulasen unproduktiv bindet. Es wird angenommen, dass eine LMS-Behandlung die unproduktive Bindung der Cellulasen an Lignin durch oxidative Modifikationen reduziert. Mit Hilfe des Fluoreszenzproteins mCherry konnte bestätigt werden, dass die unspezifische Proteinadsorption an die Oberfläche von Buchenholz durch LMS-Vorbehandlung signifikant reduziert wird. Vor dem Hintergrund dieser Ergebnisse stellte sich die LMS-Vorbehandlung als eine vielversprechende Möglichkeit heraus, um physikalisch-chemisch vorbehandelte Biomasse für eine nachfolgende, möglichst effiziente enzymatische Hydrolyse zu konditionieren. Um Biomasse hinsichtlich der Zugänglichkeit von Cellulose für Cellulasen und den Einfluss von Vorbehandlungsverfahren auf diesen Parameter weitergehend zu charakterisieren, wurden fluoreszierende Proteinsonden mit einem cellulose-bindenden Motiv (CBM) aus C. fimi entwickelt und getestet. Eine Quantifizierung der Bindungsstellen war jedoch nicht erfolgreich, da die unspezifische Bindung der Sonden an Lignocellulose die CMB-vermittelte cellulosespezifische Bindung überdeckt. Weiterhin wurde das Potential LMS-katalysierter Prozesse für die enzymatische Depolymerisation von Lignin im Kontext einer modernen Bioraffinerie validiert. Dafür wurden zunächst geeignete Reaktionsbedingungen identifiziert und der Einfluss von vier Lösemitteln sowie zwei Redoxmediatoren auf die Stabilität von zwei pilzliche Laccasen untersucht. Unter den daraus abgeleiteten bestmöglichen Reaktionsbedingungen wurde die enzymatische Depolymerisation von Organosolv-Lignin mit LMS erprobt und der Einfluss von LMS auf Lignin mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) verfolgt. Unter keinen der getesteten Bedingungen konnte jedoch eine LMS-katalysierte Lignin-Spaltung beobachtet werden, vielmehr führte die Inkubation mit LMS zu einer Aufpolymerisation des Lignins.

Within this project potential applications of fungal laccases in combination with redox mediators (so-called laccase-mediator-systems, LMS) for biorefinery purposes have been investigated. The project was part of the cluster of excellence “Tailor-made Fuels from Biomass” (TMFB) at RWTH Aachen University.Modern biorefinery concepts focus on lignocellulosic biomass as a feedstock for the production of next generation biofuels and platform chemicals. Lignocellulose is a recalcitrant composite consisting of several tightly packed components which are stuck together by the phenolic polymer lignin hampering the access to the carbohydrate compounds of biomass. Therefore, the processing of lignocellulose requires an initial, energy-intensive pretreatment for disintegration. In the context of this work the application of LMS for biomass pretreatment was addressed. It was demonstrated that the enzymatic pretreatment of beech wood with LMS has an enhancing influence on the subsequent enzymatic cellulose hydrolysis. However, this effect was only observed when LMS pretreatment was combined with subsequent freeze-drying and increased hydrolysis yields by a factor of 1.3. It is assumed that freeze-drying loosens up the structure of lignocellulose and thereby increases its surface but simultaneously also exposes more lignin which unproductively binds cellulases. LMS pretreatment most likely reduces unproductive binding of cellulases to the biomass surface by oxidative modifications of the lignin enhancing the hydrolysis performance. Adsorption studies using the fluorescent protein mCherry confirmed that LMS pretreatment significantly reduces unproductive binding of mCherry to the surface of beech wood. With respect to the obtained results LMS pretreatment is considered as promising technique to condition physico-chemically pretreated biomass for the subsequent enzymatic cellulose hydrolysis. For the characterization of biomass regarding the accessibility of the cellulose for cellulases and the impact of different pretreatment methods on this parameter fluorescent protein probes consisting of a cellulose-binding module (CBM) from C. fimi and a fluorescent reporter protein were developed and tested. However, the quantification of cellulase binding sites was not successful since unspecific adsorption of the protein probes to the biomass surface masked the CBM-specific cellulose binding. Furthermore, the application of LMS-catalyzed processes for enzymatic lignin depolymerization in the context of modern biorefineries was validated. First, suitable reaction conditions had to be identified. Therefore, the influence of different organic solvent as well as two redox mediators on the stability of two fungal laccases was investigated. From the obtained results the best possible reaction conditions were derived and applied for further experiments regarding the enzymatic depolymerization of Organosolv lignin with LMS. The influence of LMS on Organosolv lignin was analyzed using gel permeation chromatography (GPC). However, under none of the tested reaction conditions LMS-catalyzed lignin decomposition was observed, rather, incubation of Organosolv lignin with LMS leads to polymerizing reactions increasing the molecular weight of lignin.

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