Characterization of recombinant protein production in Escherichia coli and its influence on host cell metabolic activity

Rahmen, Natalie; Büchs, Jochen; Jaeger, Karl-Erich

doi:34935

Characterization of recombinant protein production in Escherichia coli and its influence on host cell metabolic activity = Charakterisierung der rekombinanten Proteinproduktion in Escherichia coli und deren Einfluss auf die Stoffwechselaktivität des Wirts

Rahmen, Natalie

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Natalie Rahmen

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (XV, 113, XVII-XLI Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen, 2015

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor) ; Jaeger, Karl-Erich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2015-12-11

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-019725
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/571310/files/571310.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/571310/files/571310.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ingenieurwissenschaften und Maschinenbau (frei) ; Recombinant protein production (frei) ; Escherichia coli (frei) ; metabolic activity (frei) ; Bacillus subtilis lipase A (BSLA) (frei) ; amino acid exchange (frei) ; silent codon exchange (frei) ; host strain characterization (frei) ; respiration activity (frei) ; metabolic burden (frei) ; online monitoring (frei) ; oxygen transfer rate (OTR) (frei) ; RAMOS (frei) ; BioLector (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Biotechnologische Prozesse sind umweltfreundlich, haben im Vergleich zu konventionellen chemischen Verfahren gewöhnlich einen geringeren Ressourcen- und Energieverbrauch und sind deshalb wirtschaftlich realisierbar. So sind sie zunehmend von Bedeutung für die Herstellung industriell relevanter Produkte. Besonders die Produktion von Proteinen und Enzymen spielt eine wichtige Rolle, da diese vielfältige Anwendungsmöglichkeiten in der pharmazeutischen, Lebensmittel- und chemischen Industrie sowie der Medizin aufweisen. In Wissenschaft und Industrie wird häufig das Bakterium Escherichia coli für die biotechnologische Produktion rekombinanter Proteine eingesetzt, da es zum einen molekulargenetisch sehr gut charakterisiert ist und zum anderen eine Vielzahl an Expressionsvektoren und Wirtsstämmen zur Verfügung steht. Aufgrund der enormen Diversität der genetisch modifizierten Wirtsstämme ist die Auswahl eines geeigneten Stammes für die biotechnologische Produktion eines gewünschten rekombinanten Proteins jedoch häufig mühsam und zeitaufwendig. Ein wichtiger Aspekt bei der rekombinanten Proteinproduktion ist die sogenannte ‘metabolic burden’. Metabolic burden bezeichnet eine Belastung des mikrobiellen Stoffwechsels, die dadurch entsteht, dass Ressourcen und Energie, die dem Bakterium normalerweise für seinen eigenen Metabolismus zur Verfügung stehen, durch Plasmidreplikation, heterologe Genexpression und rekombinante Proteinproduktion entzogen werden. Dieser Material- und Energieentzug beeinträchtigt die Biomasseproduktion und Atmung des Wirtsorganismus. Das Vorkommen seltener Codons im heterologen Gen kann zu einer weiteren Beeinträchtigung der Proteinproduktion beitragen. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der rekombinanten Proteinproduktion in Escherichia coli und deren Einfluss auf die Stoffwechselaktivität des Wirtsorganismus. Dazu wurde zunächst ein einfacher Ansatz zur systematischen Charakterisierung industriell relevanter und der Identifizierung gut geeigneter T7-basierter E. coli Wirtsstämme für die rekombinante Proteinproduktion untersucht. Dabei wurde evaluiert, ob und inwieweit die Online-Messung der Atmungsaktivität zur Auswahl geeigneter Expressionsstämme geeignet ist. Die Sauerstofftransferrate (Oxygen Transfer Rate, OTR) wurde dabei mit Hilfe der RAMOS-Anlage (Respiration Activity MOnitoring System, RAMOS) bestimmt, um die metabolische Belastung des Wirts während der Produktion plasmidkodierter Proteine nachzuweisen. Sieben allgemein bekannte und häufig verwendete T7-basierte E. coli Wirtsstämme, welche die Gene für zwei rekombinante Proteine, eine Lipase des mesophilen Bakteriums Bacillus subtilis (BSLA) oder eine Oxidoreduktase des thermophilen Bakteriums Thermus thermophilus exprimieren, wurden während der Kultivierung unter nicht induzierenden und induzierenden Bedingungen verglichen.Zur weiteren Charakterisierung der rekombinanten Proteinproduktion in E. coli wurde der Einfluss kleiner Unterschiede in der heterologen lipA Gensequenz, welche für die BSLA codiert, auf die Stoffwechselaktivität des Wirtsorganismus untersucht. Dazu wurden solche E. coli BL21(DE3) Klone hinsichtlich ihrer metabolischen Aktivität analysiert, die kleine Unterschiede in der lipA Gensequenz tragen, die entweder zu einzelnen Codonaustauschen im Gen oder zu einzelnen Aminosäureaustauschen im Protein führen. Die Aminosäureaustausche waren dabei zufällig gewählt und über die gesamte Proteinsequenz der BSLA verteilt. Stille Mutationen innerhalb der für die BSLA kodierenden Sequenz wurden eingeführt, um an zwei zufällig definierten Positionen alle möglichen synonymen Arginin- und Leucincodons zu analysieren. Ferner wurden Klone untersucht, die identische Aminosäureaustausche unter Verwendung verschiedener synonymer Codons tragen. Die entsprechenden E. coli Klone wurden mit Hilfe spezialisierter Online- und Offline-Messtechniken während der Kultivierung in einem definierten Autoinduktionsmedium verglichen. Die RAMOS-Anlage wurde verwendet, um den metabolischen Zustand des rekombinanten Organismus quantitativ zu analysieren. Weiterhin wurden die Biomasse- und Proteinproduktion mit Hilfe des BioLector Systems bestimmt. Weitere Kultivierungsparameter, wie zum Beispiel die Verstoffwechslung der Kohlenstoffquellen oder die Plasmidkopienzahl wurden evaluiert, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen näher zu analysieren. In dieser Arbeit konnte zunächst gezeigt werden, dass die Online-Messung der Atmungsaktivität mittels RAMOS-Anlage eine einfache Abschätzung der rekombinanten Proteinproduktion ohne aufwendige Offline-Proteinbestimmung ermöglicht und so eine Identifikation geeigneter T7-basierter E. coli Wirtsstämme erlaubt. In Mineralmedium konnten unter IPTG- und Autoinduktion sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Korrelation zwischen der Atmungsaktivität und der Proteinproduktion für die untersuchten E. coli Stämme nachgewiesen werden. Unter den hier gewählten Bedingungen war E. coli BL21(DE3) der am besten geeignete Stamm für die rekombinante Produktion der BSLA mittels IPTG- und Autoinduktion. Die kleinen Modifikationen innerhalb der lipA Gensequenz führten zu starken, sehr reproduzierbaren Unterschieden in Atmungsaktivität, Biomasse- und Zielproteinproduktion. Eine quantitative Evaluation der Atmungsaktivität ermöglichte die Klassifizierung aller untersuchten Klone in zwei verschiedene Typen: Typ A und Typ B. Weiterhin konnten unter Berücksichtigung der Atmungsaktivität fünf charakteristische Kultivierungsphasen identifiziert werden, die zum einen Informationen über die sequentielle Verstoffwechslung der verschiedenen Kohlenstoffquellen liefern, zum anderen Aufschluss darüber geben, in welchen Phasen der Kultivierung Biomasse oder Protein gebildet wird. Tendenziell zeigten Typ A Klone eine höhere Produktbildung, Typ B Klone hingegen eine stärkere Biomasseproduktion. Um ein tieferes Verständnis der phänomenologischen Unterschiede zwischen den beiden Typen A und B zu erhalten, wurde eine Reihe potentieller Faktoren untersucht, welche eine Ursache für die zwei Verhaltensmuster der Atmungsaktivität darstellen könnten. Die Verfügbarkeit intrazellulärer Nukleobasen sowie Codon Usage, metabolische Kosten für die Aminosäurebiosynthese, Enzymaktivität, die Bildung von Einschlusskörperchen (inclusion bodies) oder das Verhältnis von unlöslichem zu löslichem Protein zeigten hier jedoch weder einen Einfluss auf heterologe Genexpression und rekombinante Proteinproduktion noch waren sie Ursache für die Unterschiede zwischen Typ A und Typ B Klonen. Dennoch konnte gezeigt werden, dass die kleinen Unterschiede innerhalb der heterologen lipA Gensequenz ein reduziertes initiales Wachstum der Typ B Klone verursachten, welches wiederum zu einer geringeren Biomassekonzentration zum Induktionszeitpunkt führte. In der Folge waren die Plasmidkopienzahl und das Expressionslevel geringer als bei den Typ A Klonen und die Verstoffwechslung der Kohlenstoffquellen Lactose und Glycerin änderte sich. Obwohl die zugrundeliegenden molekularen Ursachen noch nicht identifiziert sind, konnte in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, dass kleinste Änderungen in der Sequenz eines heterologen Genes, die lediglich zu einzelnen Aminosäure- oder Codonaustauschen führen, immense Auswirkungen auf den Metabolismus des Wirtsorganismus und die rekombinante Proteinproduktion haben. In Zukunft kann dies enorme Auswirkungen auf die Codon-Optimierung heterologer Gene, die Screening-Prozesse nach verbesserten Enyzmvarianten sowie die Prozesse zur biotechnologischen Proteinproduktion haben.

Biotechnological processes are environmentally friendly, often require less resources and energy compared to conventional chemical processes and are therefore economically feasible. Hence, they are of increasing importance for the production of industrially relevant products. In particular, the production of proteins and enzymes plays an important role since they have versatile possible applications in the field of medicine, pharmaceutical, food or chemical industry. The bacterium Escherichia coli is commonly used in academia and industry for the biotechnological production of recombinant proteins because of its well-characterized molecular genetics and the availability of numerous expression vectors and host strains. Due to the great diversity of genetically modified expression strains, selecting an appropriate host strain for the biotechnological production of a desired recombinant protein is often laborious and time-consuming.One further important issue during recombinant protein production is the so-called ‘metabolic burden’: the material and energy normally reserved for the microbial metabolism which is sapped from the bacterium for plasmid replication, heterologous gene expression and recombinant protein production. This material and energy drain harms biomass formation and modifies respiration. Thereby, the abundance of rare codons in a heterologous gene may be a further drawback. The overall aim of this thesis was to characterize the recombinant protein production in E. coli and its influence on the metabolic activity of the host cell metabolism. First, an easy approach to systematically characterize industrially relevant and to identify well-suited T7-based E. coli host strains for recombinant protein production was investigated. Thereby, the qualification of online respiration activity measurement for selecting appropriate expression hosts was assessed. The Oxygen Transfer Rate (OTR) was determined online to monitor the host cell metabolic burden during the production of plasmid-encoded proteins using the Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS). Seven commonly applied T7-based E. coli host strains expressing the genes encoding for two recombinant enzymes, namely a lipase from the mesophilic bacterium Bacillus subtilis (BSLA) and an oxidoreductase from the thermophilic bacterium Thermus thermophiles, were compared during cultivation under non-inducing and inducing conditions. For further characterization of the recombinant protein production in E. coli it was investigated whether smallest differences within the heterologous lipA gene encoding the BSLA target enzyme affect the metabolic activity of the host organism. Therefore, E. coli BL21(DE3) clones containing small differences within the lipA gene sequence leading either to single amino acid exchanges within the recombinant protein or to even smaller differences in form of single codon exchanges within the gene were analyzed regarding their effects on the host cell metabolic activity. The amino acid exchanges were randomly distributed over the entire amino acid sequence of the target protein lipase A from Bacillus subtilis (BSLA). Silent mutations were introduced into the coding sequence of the BSLA to introduce all synonymous arginine or leucine codons at two randomly defined positions, as well as substitutions leading to identical amino acid exchanges with different synonymous codons. The respective E. coli clones were compared during cultivation in a mineral autoinduction medium using specialized online and offline measuring techniques. To quantitatively analyze the metabolic state of the recombinant organisms, the RAMOS device was applied. Biomass and product formation were determined using the microtiter plate based BioLector system. Further cultivation parameters like e.g. carbon source consumption or plasmid copy number were determined to deeper analyze the underlying molecular relations. In this thesis, it could be shown that online measurement of the respiration activity using the RAMOS device allows for a simple estimation of recombinant protein production without laborious offline protein determination as well as for a first identification of suitable T7-based E. coli host strains. In mineral cultivation media, a qualitative as well as a quantitative correlation between respiration activity and protein production could be verified for the investigated E. coli host strains under IPTG- as well as under autoinduction. Under the chosen cultivation conditions, E. coli BL21(DE3) was found to be an appropriate host strain for the recombinant BSLA production using IPTG- or autoinduction. The investigated small modifications within the lipA gene sequence resulted in strong, highly reproducible differences in respiration activity, biomass formation and target protein production of the respective E. coli clones. A quantitative evaluation of the respiration activity allowed a classification of all investigated clones into two types named Type A and Type B. With respect to the respiration activity, five characteristic cultivation phases could be identified, providing information about the time points of the depletion of the different carbon sources as well as about biomass and product formation. Type A clones indicated higher product formation, Type B clones were identified as clones with stronger biomass formation. A large number of potential factors causing the observed two patterns of respiration behavior was assessed to gain a deeper understanding of the observed phenomenological differences. The availability of intracellular nucleobases as well as codon usage, metabolic costs for the amino acid biosynthesis, enzyme activity, the formation of inclusion bodies as well as the ratio of insoluble to soluble protein neither showed any impact on heterologous gene expression and protein production nor did they cause the differences observed between Type A and Type B clones. However, the small differences in the heterologous lipA gene led to a reduced initial growth of Type B clones resulting in a lower biomass concentration at the time point of induction. As a consequence, plasmid copy number and expression level remained lower compared to Type A clones, and the consumption pattern of the carbon sources lactose and glycerol changed. Even though the underlying molecular mechanisms are not yet identified, in this thesis, the astonishing phenomenon was observed that smallest differences within a heterologous gene leading to single amino acid or silent codon exchanges tremendously affect host cell metabolism and recombinant protein production. In future, this knowledge could have enormous impact on the codon optimization of heterologous genes, screening procedures for improved enzyme variants, and biotechnological protein production processes.

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