Regulation und Transport der Disintegrin und Metalloproteinasen ADAM10 und ADAM17

Groth, Esther; Pradel, Gabriele; Ludwig, Andreas; Fabry, Marlies

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-012105

Regulation und Transport der Disintegrin und Metalloproteinasen ADAM10 und ADAM17 = Regulation and transport of the disintegrin and metalloproteinases ADAM10 and ADAM17

Groth, Esther

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Master of Science Esther Christin Groth aus Heide

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online Ressource (V, 190 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Ludwig, Andreas (Thesis advisor) ; Fabry, Marlies (Thesis advisor) ; Pradel, Gabriele (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-02-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-012105
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/569209/files/569209.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/569209/files/569209.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Chemie (frei) ; ADAM17 (frei) ; ADAM10 (frei) ; Oberflächenregulation (frei) ; Dynamin-unabhängige Internalisierung (frei) ; Exosomen (frei) ; Syndekan-1 und -4 Shedding (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 540

Kurzfassung
Die Disintegrin und Metalloproteinasen ADAM10 und ADAM17 vermitteln das Ektodomänen-Shedding vieler verschiedener membrangebundener Oberflächenproteine, wie z. B. Wachstumsfaktoren, Chemokine, Zytokine, Adhäsionsmoleküle und Rezeptoren und stehen damit im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten wie Alzheimer, Asthma, Herz-Kreislauferkrankungen, Krebs und Entzündungen. Zudem haben sie einen wichtigen regulatorischen Einfluss auf die Embryogenese und Entwicklung eines Organismus. Ihre eigene Regulation unterliegt dabei Mechanismen wie der Regulation auf Genebene, Konformationsänderungen ihrer Domänenstruktur, intrazellulärer Reifung und Transport der Proteasen, Lokalisationsveränderungen innerhalb der Membran oder einer Interaktion mit Adapterproteinen. Trotz vieler Untersuchungen in diesem Bereich ist die Regulation der Proteasen noch nicht vollkommen verstanden. Insbesondere ist noch wenig über ihre Regulation an der Zelloberfläche bekannt.In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Stimulus-abhängigen Oberflächenregulation von ADAM10 und -17 auf humanen alveolaren Tumorepithelzellen der Linie A549 durchgeführt. Es zeigte sich, dass ADAM10 durch die in dieser Arbeit verwendeten Stimuli IFNγ/TNFα, LPS, Bleomycin und PMA wenig an der Oberfläche reguliert wird, hingegen die Stimulation mit IFNγ/TNFα und Bleomycin bei ADAM17 zu einer Aufregulation führte. Auffällig war vor allem eine starke Reduktion der reifen Form von ADAM17 an der Zelloberfläche nach PMA-Stimulation. Diese steht im Gegensatz zu einer stark aufregulierten Genexpression, die sich auch im Zelllysat durch eine Anreicherung der Pro-Form von ADAM17 widerspiegelte. Trotz der Herabregulation der proteolytisch aktiven Form von ADAM17 wurde seine Aktivität deutlich gesteigert, wie in dieser Arbeit durch das Shedding der ADAM17-Substrate Syndekan-1 und -4 bestätigt werden konnte. Ein leichter Einfluss von Metalloproteinasen sowie ERK1/2 auf die Oberflächenregulation von ADAM17 wurde in diesem Zusammenhang beobachtet, jedoch konnte mit entsprechenden Inhibitoren für Metalloproteinasen bzw. ERK1/2 die Herabregulation der Oberflächenexpression von ADAM17 nicht vollständig aufgehoben werden. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass die Stimulation mit PMA nicht nur mit einer länger anhaltenden Abnahme von ADAM17 auf der Zelloberfläche, sondern auch mit einer Freisetzung von ADAM17 in Exosomen einhergeht. Die isolierten Vesikel beinhalteten neben der reifen Form von ADAM17 die exosomalen Marker CD9, CD63, Hsp70 und Flotillin-1 und wiesen eine Dichte zwischen 1,12 und 1,14 g/ml im Saccharose-Gradienten auf, sodass es sich sehr wahrscheinlich um Exosomen handelt. Zudem konnte α5-Integrin verstärkt nach Stimulation in den Exosomen nachgewiesen werden. Neben der PMA-Stimulation führte auch eine Stimulation mit dem physiologischen Stimulus LPS zu einer gesteigerten ADAM17-Freisetzung in Exosomen, nicht nur in A549-Zellen, sondern auch in der monozytären Zelllinie THP-1. ADAM10 wurde in allen Fällen konstitutiv in Exosomen freigesetzt, wobei neben der reifen Form auch die Pro-Form detektiert werden konnte. Die Biogenese der ADAM17-enthaltenden Exosomen verläuft wahrscheinlich über einen Dynamin-unabhängigen Internalisierungsweg, wie mittels Inhibitoren und siRNA- bzw. shRNA-Knockdown von Dynamin nachgewiesen werden konnte. Da ADAM17 in Flotillin-haltigen Lipid-Rafts lokalisiert ist und zusammen mit Flotillin-1 in PMA-induzierten Exosomen abgegeben wird, könnte der Internalisierungsprozess von ADAM17 mit Flotillin assoziiert sein. Untersuchungen der zytoplasmatischen Domäne von ADAM17 zeigten, dass die Defizienz der Phosphorylierungsstellen Threonin 735, Serin 794 und Serin 822 keinen Einfluss auf PMA-induziertes JAM-A-Shedding und die Freisetzung von ADAM17 in Exosomen hat, jedoch scheint das Fehlen des C-Terminus die Freisetzung der Protease in Exosomen zu verhindern. Durch durchlusszytometrische Untersuchungen der PMA-induzierten Exosomen konnte nachgewiesen werden, dass ADAM10 und ADAM17 zumindest auf einem Teil der Exosomen mit dem N-Terminus nach außen orientiert sind. Obwohl die Metalloproteinase-Domäne nach außen gerichtet ist, zeigten jedoch Syndekan-Shedding-Versuche keinerlei Beitrag von ADAM17, wie mittels Knockdown von ADAM17 gezeigt wurde. Stattdessen scheint ADAM10 in diesem Fall die Spaltung der Syndekane zu übernehmen. In dieser Arbeit konnte ein neuer Regulationsmechanismus für ADAM17 aufgezeigt werden. Welche Rolle dieser unter physiologischen Bedingungen spielt, muss in weiteren Studien noch untersucht werden.

By mediating proteolytic shedding of several transmembrane proteins like growth factors, cytokines, adhesion molecules, and receptors on cell surface, the disintegrin and metalloproteinases ADAM10 and ADAM17 function as critical regulators of different diseases like Alzheimer, asthma, cardiovascular disease, cancer, and inflammation. Furthermore, they play a pivotal role in the regulation of embryogenesis and the development of an organism. Their own regulation is subject to several mechanisms like gene induction, conformational changes, intracellular maturation and transport of the proteases, changes of subcellular localization, or interaction with adapter proteins. ADAM10 and ADAM17 are the best investigated proteases of the ADAM-family but their regulation is still not fully understood. In particular, less is known how ADAM10 and ADAM17 can be regulated on the surface expression level and which mechanisms could be implicated.This PhD thesis investigates the stimulus-dependent surface expression of ADAM10 and ADAM17 in the human alveolar tumor epithelial cell line A549. The surface regulation of ADAM10 was not affected by cell stimulation with IFNγ/TNFα, LPS, bleomycin, and PMA, whereas ADAM17 surface expression was upregulated by bleomycin and IFNγ/TNFα cell treatment. In contrast, stimulation with PMA led to the downregulation of maturated ADAM17 on the surface. In parallel, the pro form of ADAM17 was increased in the cell lysates which was in line with an increased gene expression of ADAM17. Despite a surface reduction of mature ADAM17, the proteolytic activity of the protease was enhanced, as measured by syndecan-1 and -4 shedding. The PMA effect on ADAM17 surface regulation was slightly suppressed by inhibition of metalloproteinases or ERK1/2, but a major proportion of the PMA effect still remained in the presence of the inhibitors. It could be demonstrated for the first time that the stimulation with PMA is not only accompanied by a sustained reduction of ADAM17 on cell surface but also by a release of the mature ADAM17 form in exosomes. The released vesicles contained not only the mature ADAM17 but also the exosomal markers CD9, CD63, hsp70, and flotillin-1 and the vesicles were characterized by a density of 1.12 to 1.14 g/ml in the sucrose gradient, which indicates that they were exosomes. Furthermore, α5-integrin was detectable in the exosomes after stimulation. The exosomal ADAM17 release was also observed in monocytic THP-1 cells stimulated with LPS, indicating that such release may occur under pathophysiologic conditions in several cell types. ADAM10 was released constitutively in all cases. Not only the mature form but also the pro form was detectable. The biogenesis of ADAM17-containing exosomes seems to be dynamin-independent, as shown by inhibition experiments and knockdown of dynamin via shRNA and siRNA. But ADAM17 is co-localized with flotillin-1 in lipid rafts and in the PMA-induced exosomes. Therefore, an internalization process which presumably precedes the exosome formation and release of ADAM17 could be flotillin-1-associated. The investigations of the cytoplasmic domain of ADAM17 revealed that the deficiency of the phosphorylation sites threonine 735, serine 794, and serine 822 has no effect on PMA-induced JAM-A shedding or on PMA-induced exosomal release of ADAM17. But the complete deletion of the ADAM17 C-terminus could prevent the release of the protease in exosomes. Flow cytometry analysis of PMA-induced exosomes indicated that at least a part of the ADAM10 and ADAM17 molecules are orientated on the exosomal surface with their protease domain outside. Despite this orientation, the analysis of syndecan shedding with exosomes of knockout cells demonstrated that exosomal ADAM17 does not participate in the shedding of syndecans while syndecan shedding by ADAM10 could be observed.A new regulation mechanism for ADAM17 was revealed. Its physiological function has to be examined in further investigations.

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