Vergleich der Wirt- und Nichtwirt-Interaktion von Gerste mit verschiedenen Magnaporthe-Arten anhand von histologischen Untersuchungen, Transkriptomstudien und funktionalen Genanalysen

Delventhal, Rhoda; Slusarenko, Alan; Schaffrath, Ulrich

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-011459

Vergleich der Wirt- und Nichtwirt-Interaktion von Gerste mit verschiedenen Magnaporthe-Arten anhand von histologischen Untersuchungen, Transkriptomstudien und funktionalen Genanalysen = Comparison of the host and nonhost interaction of barley with different Magnaporthe species by histological investigations, transcriptomics and functional gene analyses

Delventhal, Rhoda^RWTH*

2015 & 2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Diplom-Biologin Rhoda Delventhal aus Aachen

ImpressumAachen 2015

Umfang1 Online-Ressource (268 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen, 2015

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2016

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Schaffrath, Ulrich (Thesis advisor) ; Slusarenko, Alan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2015-06-22

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-011459
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/568204/files/568204.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/568204/files/568204.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Magnaporthe (frei) ; Nichtwirt-Resistenz (frei) ; Triticeae (frei) ; nonhost resistance (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Verschiedene Pflanzenpathogene, wie der „Rice Blast“-Erreger Magnaporthe oryzae, gefährden die Erträge der für die Welternährung wichtigen Getreide Gerste und Weizen. Gleichzeitig sind die beiden Getreidearten gegen nicht angepasste Pathogenarten vollständig und dauerhaft resistent, so auch gegen eine Magnaporthe-Art, die von Süßgräsern der Gattung Pennisetum isoliert wurde. Zur Aufklärung der bislang nicht genau verstandenen Mechanismen dieser ‘Nichtwirt-Resistenz‘ sollten im Rahmen dieser Arbeit Gene identifiziert werden, die zu ihrer Etablierung beitragen.Dazu wurden Microarray-Analysen des Transkriptoms von Gerste während der Wirt-Interaktion (WI) mit einem M. oryzae-Isolat und während der Nichtwirt-Interaktion (NWI) mit einem Pennisetum-assoziierten Magnaporthe-Isolat durchgeführt. Um die Bedeutung einzelner Kandidatengene näher zu untersuchen, wurde ihre Transkriptakkumulation mit mikroskopisch beobachteten Stadien der NWI korreliert und mithilfe des Virus-induzierten Gene Silencing (VIGS) gezielt reduziert.Das Transkriptom von Gerste reagierte auf die Magnaporthe-Inokulation sowohl in der WI als auch der NWI mit einer veränderten, größtenteils verstärkten, Expression mehrerer tausend Gene. Von den Genen, die dieser generellen transkriptionellen Umprogrammierung unterlagen, wurden 189 Kandidatengene identifiziert, die in der NWI signifikant stärker exprimiert wurden als zu demselben Zeitpunkt in der WI und die daher eine Funktion in der Nichtwirt-Resistenz haben könnten. In ersten VIGS-Experimenten führte die verminderte Expression einzelner Kandidatengene nicht zu einem vollständigen Bruch der Nichtwirt-Resistenz, wirkte sich jedoch quantitativ auf die Effektivität einzelner Abwehrreaktionen aus. Im Detail untersucht wurde der Resistenzbeitrag des bereits zuvor identifizierten Kandidatengens CYP96B22, das für eine putative Cytochrom P450-Monooxygenase (CYP) codiert und dessen Expression in einer sehr frühen Phase der NWI (6 h p.i.) induziert wurde. Tatsächlich löste bereits das Magnaporthe-Wachstum auf der Blattoberfläche eine erhöhte CYP96B22-Expression aus. So trat die CYP96B22-Induktion auch dann noch auf, wenn die Bildung funktionaler Appressorien durch ein Fungizid reduziert wurde oder in einer Magnaporthe-Mutante ausblieb. Dies belegt, dass Gerste und Magnaporthe-Isolate durch die intakte Pflanzenoberfläche noch vor der Penetration des Pathogens Signale austauschen. Nach einer Reduktion des CYP96B22-Transkriptgehalts durch VIGS wurden auf mikroskopischer Ebene weniger effektive Papillen in der NWI und ein erhöhtes invasives Magnaporthe-Wachstum in der WI festgestellt. Dies deutet auf einen wichtigen Beitrag von CYP96B22 in der Penetrationsresistenz gegen Magnaporthe hin. Da andere Vertreter der CYP96-Familie an der Biosynthese epicuticulärer Wachse beteiligt sind, könnte CYP96B22 an der Bereitstellung von Wachskomponenten für strukturelle Barrieren oder der Synthese von Molekülen, die Signale zur Induktion von Abwehrreaktionen darstellen, beteiligt sein.Die Gerste-Transkriptomanalyse war Teil des ERA-PG-Projektes „TritNONHOST“, in dem in experimentell gleich angelegten Microarray-Analysen die WI und NWI von Gerste und Weizen mit drei verschiedenen Pathogenen (Magnaporthe, Blumeria und Puccinia) untersucht wurden. Ein Abgleich der Daten zeigte, dass ein großer, sich überschneidender Gen-Satz von der generellen transkriptionellen Umprogrammierung in allen Pathogen-Interaktionen betroffen war. Demgegenüber waren die Nichtwirt-spezifischen Kandidatengene, die für die Interaktionen mit Blumeria und Puccinia identifiziert wurden, verschieden von den für die Magnaporthe-Interaktion identifizierten Kandidaten. Diese Ergebnisse weisen in Übereinstimmung mit zuvor veröffentlichten Studien auf eine vom Pathogen abhängende, spezifische transkriptionelle Nichtwirt-Antwort hin.In einem Projekt zur Untersuchung des Pathogen-Beitrags zur NWI wurde beobachtet, dass eine Erstinfektion mit Blumeria graminis f. sp. hordei (Bgh) Anfälligkeit gegen ein Magnaporthe-Nichtwirt-Isolat induzieren kann. Dies verdeutlicht, dass das Nichtwirt-Isolat prinzipiell in der Lage ist, Gerste zu besiedeln. Dazu ist es allerdings auf die Aktivität eines kompatiblen Wirt-Pathogens (hier Bgh) angewiesen, welche in den Pflanzenzellen eine Zugänglichkeit für invasives Pathogenwachstum induziert. Dem Nichtwirt-Isolat könnten also zur Infektion aufGerste lediglich bestimmte Pathogenitätsfaktoren, die in der Etablierung der WI eine wichtige Rolle spielen, fehlen. Um solche Pathogenitätsfaktoren (Effektormoleküle) von dem Wirt-Pathogen M. oryzae zu identifizieren, wurden Microarray-Experimente durchgeführt, in denen das Magnaporthe-Transkriptom während der WI und der NWI verglichen wurde. Es wurden 166 Effektor-Kandidatengene identifiziert, die das Wirt-Isolat in planta stärker exprimierte als das Nichtwirt-Isolat.Zusammenfassend bilden die auf Pflanzen- und Pathogenseite in dieser Arbeit erstellten Kandidatengen-Listen eine umfangreiche Basis zur weiteren Entschlüsselung von Mechanismen der Nichtwirt-Resistenz. Dieses Wissen könnte in der Zukunft zur Züchtung neuer Getreidesorten mit verbesserter Krankheitsresistenz eingesetzt werden.

Wheat and barley crops are essential for world food security. Both crop species are susceptible to Magnaporthe oryzae, the causal agent of rice blast. However, both plant species are completely and stably resistant against isolates of a Magnaporthe species pathogenic on the grass genus Pennisetum. The mechanisms of this ‘nonhost resistance‘ are not yet fully understood, and the present thesis aimed at identifying genes contributing to its establishment.Thus, microarray analyses of the barley transcriptome during a host interaction (HI) with a M. oryzae isolate and during a nonhost interaction (NHI) with a Pennisetum-associated Magnaporthe isolate were performed. The role of individual candidate genes was investigated in more detail by relating their expression patterns to cellular infection stages observed by microscopy and by the targeted reduction of transcript abundance using a virus-induced gene silencing (VIGS) approach.In both HI and NHI the barley transcriptome responded to Magnaporthe inoculation with an altered, mostly up-regulated, expression of several thousand genes. Among the genes underlying this general transcriptional re-programming 189 candidate genes were identified whose expression was higher during NHI than during HI at aquivalent timepoints, and which could therefore play a role in nonhost resistance. In VIGS experiments the reduced expression of some single candidate genes did not cause a complete break of nonhost resistance, but did affect plant defense reactions in a quantitative manner. The role of the previously identified candidate gene CYP96B22 was analysed in more detail. This gene encodes a putative cytochrome P450 monooxygenase and its expression was induced by 6 h p.i. in NHI. In fact, the pre-penetration growth of both adapted and non-adapted Magnaporthe isolates on the leaf surface already triggered an enhanced transcript accumulation of CYP96B22. This was evidenced, when appressorium formation was reduced or absent, either after fungicide treatment or in a fungal mutant, and CYP96B22 induction still occurred. Therefore, it was concluded that barley and Magnaporthe isolates exchange signals across the intact plant surface before penetration. Microscopy revealed a decrease in effective papillae in the NHI and an increase of invasive pathogen growth in the HI after reduction of CYP96B22 transcript abundance by VIGS. This indicates a crucial function of CYP96B22 in the penetration resistance against Magnaporthe. Since other members of the CYP96 family have been shown to be involved in the biosynthesis of epicuticular waxes, CYP96B22 may contribute to the provision of wax components for structural barriers or to the synthesis of signal molecules.The barley transcriptome analysis was part of the ERA-PG project „TritNONHOST“, in which HI and NHI of barley and wheat with three different pathogens (Magnaporthe, Blumeria and Puccinia) were investigated using a similar experimental setup. Data analyses revealed a large, overlapping gene set underlying the general transcriptional reprogramming in all pathogen interactions. However, nonhost resistance candidate genes identified for Blumeria or Puccinia interactions were different from those identified for the Magnaporthe interaction. These results account for a specific transcriptional nonhost response depending on the pathogen, and are in agreement with results for barley published previously by our group. In a project focusing on the fungal contribution to NHI it was observed that a prior inoculation of barley with Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh) induced susceptibility to the nonhost Magnaporthe isolate. This illustrates that the nonhost isolate, in principal, is able to infect barley. But to do this, it requires the activity of a compatible host pathogen like Bgh which can induce accessibility of plant cells to invasive pathogen growth. Thus, the nonhost isolate may only lack particular pathogenicity factors which play an essential role in the establishment of the HI. For identification of such pathogenicity factors (effector molecules) expressed by the host pathogen M. oryzae, a comparative microarray study of the Magnaporthe transcriptome during HI and NHI was performed. This led to identification of 166 effector candidate genes whose in planta expression was stronger in the host than in the nonhost isolate.In conclusion, the lists of fungal and plant candidate genes documented in the present thesis form a comprehensive basis for further dissection of nonhost resistance mechanisms. This knowledge may be exploited for breeding of new cereal cultivars with improved disease resistance in the future.

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