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Single cell analysis of microbial production strains in microfluidic bioreactors = Einzelzellanalyse von mikrobiellen Produktionsstämmen in mikrofluidischen Bioreaktoren = Single-cell analysis of microbial production strains in microfluidic bioreactors



VerantwortlichkeitsangabeAlexander Manuel Grünberger

ImpressumJülich : Forschungszentrum Jülich, Zentralbibliothek 2015

ISBN978-3-95806-092-0

ReiheSchriften des Forschungszentrums Jülich : Reihe Schlüsseltechnologien ; 114


Dissertation, RWTH Aachen, 2014

Druckausgabe: 2015. - Onlineausgabe: 2015. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University 2016


Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
;

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-11-13

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-059827
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/540646/files/540646.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/540646/files/540646.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

  1. Lehrstuhl für Computational Systems Biotechnology (FZ Jülich) (420410)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ingenieurwissenschaften und Maschinenbau (frei) ; microfluidics (frei) ; single-cell analysis (frei) ; Picoliter bioreactor (frei) ; Corynebacterium glutamicum (frei) ; bioprocess development (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Seit Jahrzehnten werden mikrobielle Produktionsprozesse für die Umsetzung nachwachsender Rohstoffe zu industriell genutzten Grund- und Feinchemikalien verwendet. Das Auftreten von unterschiedlichen Subpopulationen (z.B. in Wachstum und Produktion) in mikrobiellen Produktionsprozessen kann einen signifikanten Einfluss auf Ertrag und Stabilität haben. Im Allgemeinen werden biologische Prozesse basierend auf Durchschnittswerten analysiert und optimiert. Hierbei bleibt jedoch das Verhalten einzelner Zellen unbeachtet, mit oftmals nicht abschätzbaren Folgen. Essentiell für die Wirtschaftlichkeit von etablierten als auch neuen Bioprozessen sind deshalb fundierte Kenntnisse bezüglich der Ursache und Ausmaßes von Populationsheterogenität, sowie den zugrunde liegenden molekularen Vorgängen. Die Forschung und Entwicklung im Bereich der mikrofluidischen Einzelzellanalysen hat in den letzten Jahren einen Aufschwung erlebt. Fortschritte in den Fabrikationsmethoden ermöglichen die Herstellung immer kleinerer Strukturen, selbst im Submikrometer-Bereich. Die Verwendung von mikrofluidischen Analysetechniken wie zum Beispiel mikrofluidischen Einzelzell-Bioreaktoren, ermöglicht die Untersuchung biologischer Prozesse auf Einzelzellebene. Im Gegensatz zu konventionellen Systemen, wie zum Beispiel der fluoreszenz-markierten Durchflusszytometrie, ermöglichen mikrofluidische Kultivierungssysteme die Analyse zellulärer Prozesse mit voller räumlicher und zeitlicher Auflösung. Die Kultivierung von Zellen in mikrofluidischen Bioreaktoren bietet zahlreiche Vorteile: Durch einen kontinuierlichen Medienfluss können die Kultivierungsbedingungen wie zum Beispiel Nährstoff- und Sauerstoffversorgung optimal eingestellt werden. Für die Charakterisierung und ein besseres Verständnis von mikrobiologischen Produktionsprozessen wurden diese Systeme bisher allerdings kaum herangezogen. In dieser Arbeit wurde die Herstellung, der Aufbau und die Verwendung von Einzelzell- Bioreaktoren für die Kultivierung von Bakterien untersucht. Um dieses Ziel zu erreichen wurden folgende Arbeitspakete durchgeführt: (i) Entwicklung von Einzelzell-Bioreaktoren für die Fixierung und die Kultivierung von Mikroorganismen; (ii) Etablierung eines Fertigungsprozesses für die Herstellung einer Abgussform; (iii) Abguss und Herstellung eines Polymer-Glas Chips; (iv) Aufbau der mikroskopischen Versuchseinheit für die Echtzeit-Beobachtung industriell genutzter Bakterienstämmen. Die Einzelzell-Bioreaktoren wurden für erste Wachstums- und Metabolismusstudien der industriell genutzten Bakterien Corynebacterium glutamicum und Escherichia coli genutzt. In diesem Kultivierungssystem wurden für C. glutamicum höhere Wachstumsraten im Vergleich zu konventionellen Kultivierungen gemessen. Weitere systematische Analysen beinhalteten sowohl Untersuchung von Wachstum und Morphologie einzelner Kolonien und Zellen bei verschiedenen Medienbedingungen, als auch die Untersuchung seltener zellulärer Ereignisse, wie dem Auftreten von spontan induzierter SOS Antwort von C. glutamicum. In einer Vergleichsstudie mit alternativ entwickelten Einzelzell-kultivierungssystemen (Agarose Pads und Dielektrophorese-Reaktoren) wurde der Einfluss der verschiedenen Kultivierungssysteme auf die Physiologie von C. glutamicum näher untersucht. Es konnten signifikanten Unterschiede bezüglich des Wachstumsverhaltens von C. glutamicum in den verschiedenen Systemen festgestellt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die unter mikrofluidischen Bedingen erzielten höheren Wachstumsraten von C. glutamicum näher untersucht. Systematische Untersuchungen in verschiedenen Kultivierungsmaßstäben (Pikoliter bis Liter) bestätigten die höheren Wachstumsraten im Pikoliter-Kultivierungsmaßstab. Durch detailliertere Studien in verschiedenen Kultivierungsmaßstäben sowie diverser gerichteter und ungerichteter Analyseverfahren konnte der Faktor gefunden werden, der für die höheren Wachstumsraten verantwortlich ist. Protocatechusäure, ursprünglich als Eisenchelator dem Medium zugesetzt, wird parallel zu Glukose als zusätzliche Kohlenstoffquelle verstoffwechselt. Erste Studien zeigen, dass auch in traditionellen Kultivierungssystemen eine höhere Wachstumsrate erreicht werden kann, solange dem Organismus Protocatechusäure in ausreichender Menge zur Verfügung steht. Zuletzt wird ein Ausblick über weitere Anwendungsmöglichkeiten der entwickelten Einzelzellsysteme gegeben. Die Flexibilität im Herstellungsprozess kann genutzt werden, um die vorgestellten mikrofluidischen Systeme der jeweiligen biologischen Fragestellung anzupassen. Dies erhöht nicht nur das Spektrum an Anwendungsmöglichkeiten, wie z.B. Langzeit-Wachstumsuntersuchungen, sondern ermöglicht auch die Untersuchung anderer biotechnologisch wichtiger Organismen wie z.B. Pilze und Hefen. Die Beispiele zeigen, dass mikrofluidische Einzelzell-Bioreaktoren nicht nur Einblicke in zelluläre Vorgänge ermöglichen, sondern auch das Potential bieten Bioprozesse nachhaltig zu verstehen und zu verbessern. In den folgenden Jahren gilt es nun die Systeme zu optimieren, zu charakterisieren, aber auch die Grenzen derartiger Systeme eingehend zu bewerten.

Industrial biotechnology is concerned with the sustainable production of, for example, fine and bulk chemicals, pharmaceuticals and proteins by utilizing microorganisms for the conversion of renewable carbon sources. Well known examples include the production of amino acids by Corynebacterium glutamicum at a million ton scale per year worldwide, or the recombinant production of insulin by Escherichia coli. Growth and productivity of the underlying host microorganisms are two key performance indicators in biotechnological production processes. Assuming isogenic starting populations, optimal reactor control and mixing, a uniform cell behavior during growth might be expected. However, as confirmed in recent years, isogenic bacterial populations can be physiologically heterogeneous. Obviously, there is a strong demand to unravel microbial population heterogeneity, understand its origin and gain knowledge on its impact on large scale biotechnological production. Therefore, new analytical techniques addressing single-cell behavior are the key for further optimization. In particular, state-of-the-art microfluidic cultivation systems facilitating single-cell resolution and accurate environmental control over long time periods at the same time, offer completely new experimental assays on microbial populations. In contrast to conventional systems, for example, fluorescence activated cell sorting, microfluidic cultivations enable the analysis of cell dynamics by automated time-lapse microscopy with full spatio-temporal resolution. The aim of the present thesis was to develop and establish a new microfluidic platform technology for microbial single-cell analysis in order to address key concerns on population heterogeneity and reactor inhomogeneity in industrial biotechnology. Several unique single-cell cultivation chips were successfully fabricated and validated with a variety of industrially applied microorganisms. Each device contained up to several thousand micrometer sized cultivation structures in parallel intended for high-throughput analysis of single cells and isogenic microcoloniesIn the present research two major single-cell investigations were performed demonstrating the universal applicability and potential of the microfluidic single-cell cultivation technology:(i) Growth analysis of industrially relevant bacteria (in particular E. coli and C. glutamicum) with single-cell resolution was performed. Therefore, isogenic microcolonies were grown in monolayers up to several hundred cells in each growth chamber and imaging was performed by time-lapse microscopy. Compared to a typical 1 liter lab-scale batch cultivation, interestingly a 1.5-fold enhanced growth rate of C. glutamicum wild type cells under constant microfluidic cultivation conditions was found. (ii) Morphological characterization: The cellular response of several C. glutamicum strains under various environmental conditions was investigated in more detail. Studies included artificially induced starvation, occurrence of spontaneously induced stress response of single cells, as well as morphological characterization during growth on different carbon sources. In a multi-scale approach, the elevated single-cell growth rates were investigated in more detail. Therefore, various lab-scale cultivations were performed and results compared with our microfluidic single-cell analysis. This systematic study revealed a maximum growth rate of μ_max=0.6 h^(-1) during microfluidic cultivation compared to μ_max=0.4 h^(-1) during bioreactor, flask and microtiter cultivation. Further single-cell analysis exposed that solely the medium composition was the growth enhancing factor, rather than the continuous perfusion during single-cell cultivation or the analytical method itself. It turned out that the medium compound protocatechuate (PCA), initially added as iron chelator, serves as an additional carbon source and is co-metabolized by C. glutamicum, resulting in higher growth rates when PCA is continuously supplied during microfluidic cultivation. In contrast, the limited amount of PCA is fully consumed during the early process of a typical batch process. Follow-up studies proved that even in conventional batch cultivation systems, the improved growth rates can be realized if PCA is made accessible for a longer time. Short innovation times allowed the fabrication of tailor made systems depending on microbial species and application. In an overview, it is shown, how these systems can be used to cultivate other industrial important organisms such as fungi and yeast. Furthermore, examples are given how the developed system in combination with genetically modified fluorescence sensors can be used to investigate heterogeneity of growth coupled production processes at the single-cell level. The results confirm that cell-to-cell heterogeneity can have significant impact on production processes and need to be further investigated in future. In the present project, novel single-use microfluidic cultivation devices with structures in the sub-micrometer range for trapping and cultivation of individual bacteria were developed and successfully validated. Automated live-cell imaging in combination with accurate environmental control facilitates spatio-temporal analysis of single bacteria with respect to, for example, growth, morphology and single-cell productivity. In a highly interdisciplinary approach, the microfluidic single-cell technology was efficiently utilized to derive cellular information which was not accessible before. The presented findings clearly demonstrate the high potential of microbial single-cell analysis for biotechnological strain and process optimization. The present work established the foundation for further progress in the field.

OpenAccess:
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Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis/Book

Format
online, print

Sprache
English

Externe Identnummern
HBZ: HT018793303

Interne Identnummern
RWTH-2015-05982
Datensatz-ID: 540646

Beteiligte Länder
Germany

 GO


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Document types > Theses > Ph.D. Theses
Document types > Books > Books
Faculty of Mechanical Engineering (Fac.4)
Publication server / Open Access
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Publications database
420410

 Record created 2015-10-29, last modified 2023-04-08