Targeting of activated macrophages through CD64 to elucidate their role in the pathogenesis of Multiple sclerosis

Aslanian, Eric; Fischer, Rainer; Barth, Stefan

doi:HT018741287

Targeting of activated macrophages through CD64 to elucidate their role in the pathogenesis of Multiple sclerosis = Targeting von aktivierten Makrophagen durch CD64, um ihre Rolle in der Pathogenese bei Multipler Sklerose aufzuklären

Aslanian, Eric

2015

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Eric Aslanian

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2015

Umfang128 [Bl.] : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2015

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor) ; Barth, Stefan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2015-02-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-045255
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/481969/files/481969.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; macrophage (frei) ; CD64 (frei) ; immunotoxin (frei) ; multiple sclerosis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Multiple Sklerose ist eine komplizierte Autoimmunerkrankung des ZNS, die in entzuendlich-infiltrierte Imunzellaktivitaeten entwickelt und exazerbiert wird und anschließend zur Erhöhung des demyelinisierten Läsionen fuehrt. Entzündlichen Makrophagen (M1) spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der MS über die Produktion von Entzündungsmediatoren (TNF, IFN) und Stimulation der Immunentzündungskaskade gegen die Myelin-Antigene. Da es eine Notwendigkeit für neue und effektivere Therapeutika bestand wurde unter Berücksichtigung der zentralen Rolle dieser entzündlichen Makrophagen in MS untersucht, ob Eliminierung dieser Zellen konnten das autoimmunreaktive Kaskade gegen die neuronalen Myelinproteine unterbrechen.Charakteristisch für diese Zellen ist die Expression von & ggr; RI (CD64) -Rezeptor, die zuvor gezeigt wurde, dass ein geeignetes Ziel spezifisch M1 Populationen eliminieren. Dies wurde unter Verwendung eines Immuntoxins (IT) von einem Antikörperfragment (scFv-H22) und dem Kegelpseudomonas Bakterien Exotoxin (ETA ') zusammengeführt. Die IT-induzierte Apoptose bei Internalisierung. Wir haben daher hier gezielte M1 Makrophagen mit H22-ETA 'IT im Tiermodell für MS getarget, genannt ~experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis EAE~.In erster Linie wurde CD64-Expression auf Makrophagen-Subtypen untersucht. Die periphere Monozyten wurden aus PBMCs menschlichen Blut isoliert und an M1 (durch LPS) und M2 (IL-4), Makrophagen polarisiert. Danach CD64 Expression wurde bestätigt, dass vor allem auf M1 Makrophagen durch LPS polarisiert sind. Zusätzlich wurden hCD64 transgene Mäuse gezüchtet, und weiterhin in unserer Tiereinrichtung Zentrum verwandten Untersuchungen und Herstellung der transgenen im Vergleich zu nicht-transgenen Wurf für die Experimente entwickelt, gefolgt.Später wurden die EAE-Induktion und Behandlung erforderlich Proteinen kloniert und hergestellt werden. Unter Berücksichtigung der variablen Faktoren, die EAE Induktion beeinflussen könnten, wurden verschiedene Protokolle mit verschiedenen ausgedrückt MOG, gekauft MOG und EAE Induktions Kits getestet. Letztlich wurde EAE erfolgreich in menschlichen CD64-transgene C57BL / 6-Mäusen induziert werden, unter Verwendung von Hooke Labors EAE Induktionssatz, kompletten Freund'schen Adjuvans und Pertussistoxin ergänzt. Das Immuntoxin wurde durch bakterielle Fermentation hergestellt und gereinigt, während die Bindung und toxischen Fähigkeiten wurden weiter bestimmt. Danach wurden variable Dosen, Zeitpunkte sowie Injektionsstellen untersucht, die die Einrichtung einer endgültigen, optimiertes Protokoll aktiviert. Anwendung dieses Protokolls wurde die Kinetik der verschiedenen Immunzellen, einschließlich Makrophagen in EAE untersucht. Dies wurde durch Immunhistochemie von Hirnschnitten in vier verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt, ausgehend vom Tag 6 bis 12 der EAE-Induktion. Die Sicherheit der H22-ETA 'Therapie wurde zusätzlich auf gesunden nicht-induzierten EAE Tiere überprüft. Hierzu wurden verschiedene Protokolle Immunofärbung unter Verwendung einer Vielzahl von Kombinationen von Antikörpern und Färbung Substraten.EAE wurde nach dem Protokoll entwickelt induziert, in der Mensch-CD64-transgene, C57BL / 6 Mäusen und mit H22-ETA 'Immunotoxin behandelt. Die EAE Ritzungen und damit die klinischen Symptome wurden in der behandelten Gruppe gewonnen wird, während die nicht behandelten Tiere an schweren klinischen Behinderungen und fortschreitende Verschlechterung der Krankheit leidet. Die Immunhistochemie Daten angezeigt Reduktion von M1 Zellinfiltrate einschließlich CD64 und CD14-positiven Zellen in der behandelten Gruppe im Vergleich zu den nicht behandelten und späten behandelten Kontrollen.Abschließend, die statistisch ausgewertet Daten zusammen mit den klinischen Befunden, bestätigt die Bedeutung von CD64 zielgerichtete Therapie als Kandidat für weitere Studien. Zusammengenommen könnte Targeting Makrophagen möglicherweise von Bedeutung sein, als eine neue therapeutische Strategie in MS-Krankheit. Darüber hinaus hat es das Potential, als ein der Krankheit modifizierende und wirksame Therapien für Multiple Sklerose entwickelt werden

Multiple sclerosis is a complicated autoimmune disease of the CNS that is developed and exacerbated upon inflammatory infiltrated immune cell activities and subsequent increase of demyelinated lesions. Inflammatory macrophages (M1) play a decisive role in the pathogenesis of MS through production of inflammatory mediators (TNFα, IFNγ) and stimulation of the immuno-inflammatory cascade against the myelin antigens. As there is a need for new and more effective therapeutics and considering the pivotal role of these inflammatory macrophages in MS, we investigated whether elimination of these cells could interrupt the autoimmune-reactive cascade against the neuronal myelin proteins. Characteristic for these cells is the expression of FcγRI (CD64) receptor, which was previously shown to be a suitable target to specifically eliminate M1 populations. This was done using an immunotoxin (IT) composed of an antibody fragment (H22-scFv) and the truncated pseudomonas bacterial exotoxin (ETA′). The IT induced apoptosis upon internalization. We therefore here targeted M1 macrophages with H22-ETA′ IT in the animal model for MS, called experimental autoimmune encephalomyelitis EAE.Primarily, CD64 expression was evaluated on macrophage subtypes. The peripheral monocytes were isolated from human blood’s PBMCs and polarized to M1 (by LPS) and M2 (IL-4) macrophages. Thereafter CD64 expression was confirmed to be predominantly on M1 macrophages, polarized by LPS. In addition, hCD64 transgenic mice were bred and further developed in our own animal facility center, followed by related examinations and preparation of transgenic vs. non-transgenic littermates for the experiments. Later, the proteins required for EAE induction and treatment were cloned and produced. Considering the variable factors that could influence EAE induction, different protocols were tested using various expressed MOG, purchased MOG, and EAE induction kits. Ultimately, EAE was successfully induced in human-CD64 transgenic C57BL/6 mice, using Hooke laboratory’s EAE induction kit, supplemented with complete Freund’s adjuvant and pertussis toxin. The immunotoxin was produced through bacterial fermentation and purified, while its binding and toxic abilities were further determined. Thereafter, variable doses, time points, as well as injection sites were evaluated, which enabled the establishment of a final, optimized protocol. Applying this protocol, the kinetics of different immune cells, including macrophages were studied in EAE. This was done through immunohistochemistry of brain sections at four different time points, starting from day 6 to day 12 of EAE induction. The safety of H22-ETA′ therapy was additionally verified on healthy non-EAE induced animals. For this, several immunostaining protocols were developed using a variety of combinations of antibodies and staining substrates. EAE was induced according to the developed protocol, in human-CD64 transgenic, C57BL/6, mice and treated with H22-ETA′ immunotoxin. The EAE scorings and therefore the clinical signs were recovered in the treated group, while the non-treated animals were suffering from severe clinical disabilities and progressive deterioration of the disease. The immunohistochemistry data displayed reduction of M1 cell infiltrates including CD64 and CD14 positive cells, in the treated group comparing to the non-treated and late-treated controls. Conclusively, the statistically evaluated data together with the clinical findings, confirmed the importance of CD64 targeted therapy as a candidate for further studies. Taken together, targeting macrophages could potentially be significant, as a new therapeutic strategy in MS disease. Furthermore, it has the potential to be developed as one of the disease modifying and effective therapies, for Multiple Sclerosis.

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