Non-linear optical microscopy in clinical translation : imaging of postinterventional endothelial regeneration

Wu, Zhuojun; Kießling, Fabian; Elling, Lothar

doi:HT018728232

Non-linear optical microscopy in clinical translation : imaging of postinterventional endothelial regeneration

Wu, Zhuojun

2015

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Zhuojun Wu

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2015

Umfang86 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2015

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Kießling, Fabian (Thesis advisor) ; Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-036738
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/480436/files/480436.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Endothel spielt nicht nur eine wichtige Rolle im Verlauf von Arteriosklerose, sondern auch in anderen inflammatorischen Erkrankungen wie Vaskulitis. Endotheliale Aktivierung wird durch abnormale Scherspannung, lokale Entzündung sowie Chemokinausschüttung ausgelöst, gefolgt von der Hochregulierung von Zelladhäsionsmolekülen wie beispielsweise das intrazelluläre Adhäsionsmolekül 1, das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül 1 und Selektine. Diese Zelladhäsionsmoleküle fördern die Migration von Immunzellen und sind für den Verlauf von Entzündungen verantwortlich. Diese Moleküle werden ebenfalls hochreguliert nach vaskulären Intervention wie z.B. Ballonangiographie mit Stent Implantation und Endoarteriektomie. Während der endothelialen Wundheilung ist ein Blutgefäß anfällig für Thrombusformation sowie Akkumulation von Immuzellen und Restenose. Erkrankungs- und verletzungsbedingte Biomarker werden auf der luminalen Oberfläche exprimiert und stellen ein potentielles Ziel für die Bildgebung und Diagnostik dar. Das Hauptziel dieser Studie war die Etablierung eines vaskulären Kontrastmittels, welches den physiologischen Fluss- und Scherraten in Hauptarterien widerstehen kann und dabei gleichzeitig spezifisch an molekulare Marker bindet. Klinische Bildgebungsmethoden haben nur unzureichende Sensibilität und Auflösung, um einzelne Partikel zu verfolgen. Daher wurde die Zwei-Photonen Mikroskopie als eine präklinische optische Bildgebungsmethode verwendet, welche tief ins Gewebe eindringen kann, um das Expressionsmuster von Oberflächenmarkern und das Bindungsverhalten von Mikrobläschen zu charakterisieren. Mikrobläschen (MB) sind mit Luft gefüllte und auf Polymer basierende Partikeln mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 1-2 μm. Diese wurden, erstmals unter niedrigen Flussbedingungen, erfolgreich in der Tumor-Bildgebung etabliert, am Beispiel vom vaskulärem endothelialen Wachstumsfactor-Rezeptor (VEGFr). Die Beladung der Partikel mit Fluoreszenzfarbstoffen ermöglicht die bi-modale Detektion der Partikeln mit molekularem Ultraschall und Zwei-Photonen Mikroskopie. Mithilfe von Zwei-Photonen Mikroskopie wurde die Scherspannung-Resistenz von ICAM-1 spezifischen MB auf TNFα-stimulierten Karotiden in einer ex vivo Flusskammer charakterisiert. Nicht nur unter physiologischen Bedingungen, sondern auch bei weit höheren Scherraten sind gebundene MB zu beobachten. In dieser ersten proof-of-concept-Studie wurde die potentielle Anwendung von MB in entzündeten Hauptarterien gezeigt. Durch die vaskuläre Intervention wird das Endothel, welches die Dysfunktion der regulatorischen Mechanismen verursacht schwer beschädigt. Dies erhöht unter anderem das Risiko für Thrombose und Restenose. Die endotheliale Regeneration nach der Intervention ist ein lebenswichtiger Schritt für die volle Genesung von Patienten. Das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül 1 wird nach endothelialer Verletzung auf den glatten Muskelzellen überexprimiert. Während der akuten Entzündungsphase wird dieser Marker sowohl auf regenerierenden Endothelzellen als auch auf den glatten Muskelzellen exprimiert. Mit einsetzender Bedeckung der glatten Muskelzellen durch Endothelzellen, verschwindet VCAM-1 von der endothelialen Oberfläche, was diesen Rezeptor zu einem perfekten Marker für die endotheliale Regeneration macht. Mithilfe von Zwei-Photonen Mikroskopie wurden einzelne MB im Lumen verfolgt, quantifiziert und eine spezifische Bindung festgestellt. Mithilfe von molekularem Ultraschall wurde die Bindung der MB an das verletzte Endothel ebenfalls detektiert. Datenanalyse haben ergeben dass Ultraschall zwischen verschiedene Phase der Endothelregeneration unterscheiden kann und damit eine akkurate Prognose des endothelialen Zustandes geben, welches in Korrelation mit Immunhistologie und 3D-Rekonstruktion der luminalen Oberfläche steht.

The endothelium plays an important role, not only in the progression of atherosclerosis, but also vasculitis and other inflammatory diseases. Endothelial activation triggered by abnormal shear stress, local inflammation and chemokine release is followed by the upregulation of surface adhesion molecules, such as intercellular adhesion molecule 1, vascular cell adhesion molecule 1 and selectins. These surface adhesion molecules facilitate the migration of immune cells, responsible for the elicitation of inflammation. Similarly, injury related inflammation is induced during interventional surgery such as balloon angioplasty with stent implantation and endoarterectomy. During the process of endothelial regeneration, the blood vessel is vulnerable to thrombus formation, immune cell accumulation and restenosis. Disease- and injury-associated biomarkers are expressed on the luminal surface of major arteries and pose a potential target for imaging and early diagnosis. In this study, the main aim was to establish a vascular contrast agent that can withstand physiological flow and shear stress conditions in major arteries while specifically binding to a molecular target long enough for imaging. Clinical imaging modalities lack sufficient sensibility and resolution for tracking single particles. Two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) was applied as a deep-tissue imaging modalities for the characterization of surface marker expression and binding kinetics of rhodamine-loaded microbubbles as a preclinical step towards translation. Microbubbles, a polymer-based air-filled particles with the diameter of 1-2 µm (MB) have been previously established in tumor imaging, which are able to attach to the vascular endothelial growth factor receptor at relatively low flow rates. Fluorescent loading of the MB shell promotes the bimodal detection of the particles both using TPLSM and molecular ultrasound. Using TPLSM imaging on TNFα stimulated explanted murine carotid arteries in an ex vivo flow chamber system, the shear stress resistance of intercellular adhesion molecule 1 targeted MB were characterized at shear rates matching and exceeding physiological conditions, showing its potential imaging application in inflamed major arteries in this first proof-of-concept study. During vascular intervention, the endothelium is severely injured and inflamed, resulting in dysfunction of the regulatory mechanisms of the endothelium, increasing thrombosis and restenosis risk. Endothelial regeneration following intervention is a crucial step towards full recovery of patients. Vascular cell adhesion molecule 1 is expressed after endothelial denudation on the medial smooth muscle cells, during the acute inflammation phase on both the smooth muscle layer and regenerating endothelial cells, but disappears from the endothelial layer after recovery, making it the perfect molecular marker to track endothelial healing. Using in vivo TPLSM, single MB bound to the vascular lumen was imaged and quantified showing specific retention. Translation into molecular ultrasound confirmed injury-specific MB retention and accurate prediction of the endothelial state in correlation with immunohistology and TPLSM imaging of the luminal surface.

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