Itaconic acid production by ustilago maydis

Geiser, Elena; Bölker, Michael; Blank, Lars M.

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-025731

Itaconic acid production by ustilago maydis = Itakonsäureproduktion von Ustilago maydis

Geiser, Elena

2015 & 2015

VerantwortlichkeitsangabeElena Geiser

Ausgabe1. Aufl.

ImpressumAachen : Apprimus-Verl. 2015

UmfangXIII, 131 S. : Ill., graph. Darst.

ISBN978-3-86359-316-2

ReiheApplied microbiology ; 1

Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2015

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor) ; Bölker, Michael (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2015-02-19

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-025731
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/478377/files/478377.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/478377/files/478377.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften (frei) ; Ustilago maydis (frei) ; itaconate (frei) ; itaconic acid (frei) ; Biologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Hauptziel dieser Arbeit war die Etablierung von Ustilago maydis als alternativen Ganzzell-Biokatalysator zur Biosynthese von Itaconsäure aus erneuerbaren Substraten, wie zum Beispiel Cellulose oder Hemicellulose. Da die mikrobielle Produktion von biotechnologisch wertvollen und bedeutenden Chemikalien stark durch die Medienzusammensetzung beeinflusst wird, ist diese ein integraler Bestandteil der biotechnologischen Prozessentwicklung. Aus diesem Grund wurde eine neue Medienzusammensetzung (modifiziertes Tabuchi Medium) für die Itaconsäureproduktion mit Ustilaginaceae entwickelt. Dieses modifizierte Tabuchi Medium beinhaltet 50 g L-1 Glukose, 0.8 g L-1 NH4Cl, 0.2 g L-1 MgSO4•7H2O, 0.01 g L-1 FeSO4•7H2O, 0.5 g L-1 KH2PO4, 1 mL L-1 Vitaminlösung, 10 mL L-1 Spurenelementlösung und als Puffer 19.5 g L-1 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES). Dadurch werden die Nachteile, wie geringe Reproduzierbarkeit und komplexe und unlösliche Medienkomponenten des Standard-Tabuchi Mediums umgangen, wodurch verlässliche physiologische Experimente ebenso wie Hochdurchsatzscreenings (HDS) ermöglicht werden.Um potenzielle neue, natürliche Biokatalysatoren für mögliche Plattformchemikalien, wie z.B. Itaconsäure, Malat oder Succinat, zu identifizieren, wurde in diesem Medium via HDS die Biodiversität der Pilzfamilie Ustilaginaceae (insgesamt 68 Ustilaginaceae aus 13 Spezies) untersucht, welche ein breites Spektrum in der Produktion von hochwertigen Chemikalien aufwies. Zusätzlich wurde der Einfluss der Pufferkonzentration (pH) auf die Säureproduktion untersucht. Ausgehend von diesem Screening wurde U. maydis MB215 als bestgeeignetster Itaconsäureproduzent ausgewählt und in Bioreaktorexperimenten näher charakterisiert. In diesen wurden Gesamtsäurekonzentration (Itaconsäure, Malat und Succinat) von 35 ± 4 g L-1 erzielt.Um die Verwendung von unbehandelten Biomassebestandteilen, wie Cellulose oder Hemicellulose, mit der Herstellung von wertvollen Plattformchemikalien, wie Itaconsäure, kombinieren zu können, wurde die Fähigkeit dieses Stammes Xylan abzubauen, untersucht. Dabei wurde die Endo-1,4-beta Xylanase UmXyn11A (um06350.1) von U. maydis, welche unter anderem für den Xylanabbau verantwortlich ist, identifiziert, charakterisiert und heterolog exprimiert. Des Weiteren wurden die geclusterten Gene (um05074 (cyp3), um05076 (tad1), um11777 (itp1), um11778 (adi1), um05079 (mtt1) und um05080 (ria1)) identifiziert, welche die für die Itaconsäureproduktion und möglicherweise deren Abbau verantwortlichen Proteine kodieren. Darauf basierend wurde ein neuer Stoffwechselweg für die Itaconsäurebiosynthese etabliert. Dieses Wissen wurde genutzt, um die Itaconsäureproduktion von U. maydis weiter zu erhöhen. Die Überexpression des Transkriptionsfaktors, welcher die Genexpression des Itaconsäure-Clusters reguliert, führte zu einer verdoppelten Itaconsäureproduktion. Mit der Identifizierung des Itaconsäure-Stoffwechselweges von U. maydis legt diese Arbeit den Grundstein für dessen weitere Optimierung und ist ein erster Schritt zur industriellen Anwendung.

The overall goal of this thesis was to establish Ustilago maydis as an alternative whole cell biocatalyst for the biosynthesis of itaconate from renewable substrates, such as cellulose or hemicellulose. Since the production of valuable and biotechnologically relevant chemicals by microorganisms is strongly influenced by the composition of the medium, its optimization is an integral part of biotechnological process development. Therefore, a new medium composition (modified Tabuchi medium) for itaconate production by Ustilaginaceae was developed. This modified Tabuchi medium consists of 50 g L-1 glucose, 0.8 g L-1 NH4Cl, 0.2 g L-1 MgSO4•7H2O, 0.01 g L-1 FeSO4•7H2O, 0.5 g L-1 KH2PO4, 1 mL L-1 vitamin solution, 10 mL L 1 trace element solution and as buffer 19.5 g L-1 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES). The modified medium circumvents the disadvantages of the standard Tabuchi medium, such as low reproducibility and complex/insoluble medium components, and therefore allows reliable physiological experiments as well as high throughput screenings (HTS).To identify potential novel natural biocatalysts for possible platform chemicals, such as itaconate, malate, or succinate, the biodiversity of the fungal family Ustilaginaceae (68 Ustilaginaceae of 13 species) was prospected in this medium via HTS, showing the production of a versatile range of value-added chemicals. Additionally, the influence of buffer concentration (pH) on acid production was investigated. Based on this screening, the most suitable itaconate producer, U. maydis MB215, was selected and characterized in more detail in bioreactor experiments obtaining total acid concentrations (itaconate, malate, and succinate) of up to 35 ± 4 g L-1.In order to combine the utilization of raw biomass components such as cellulose and hemicellulose with the production of valuable platform chemicals such as itaconate, the xylan degradation ability of this strain was investigated. Thereby, the endo-1,4-beta xylanase UmXyn11A (um06350.1) of U. maydis responsible for xylan degradation was identified, characterized, and expressed heterologously.Furthermore, the clustered genes, um05074 (cyp3), um05076 (tad1), um11777 (itp1), um11778 (adi1), um05079 (mtt1), and um05080 (ria1), encoding the proteins responsible for itaconate production and possibly its degradation in U. maydis MB215 were identified. Based on this information a novel biosynthesis pathway for itaconate was established. This knowledge was used to enhance U. maydis’ itaconate production twofold by overexpressing the transcription factor which regulates the gene expression of the itaconate cluster. With the identification of the itaconate biosynthesis pathway, this thesis lays the foundation for further optimization of this pathway and is therefore a first step towards industrial application of U. maydis as a member of the highly interesting group of Ustilaginaceae.

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