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In situ product recovery of antibodies with a reverse flow diafiltration membrane bioreactor



Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Kristina Meier

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2015

Umfang135 S. : Ill., graph. Darst.


Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2015


Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
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Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2015-02-04

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-011055
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/463902/files/463902.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/463902/files/463902.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

  1. Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ingenieurwissenschaften (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Die industrielle Herstellung von Massenprodukten erfolgt in vielen Branchen, wie beispielweise der Stahl-, Lebensmittel- oder petrochemischen Industrie, durch kontinuierliche Produktionsprozesse. Obwohl sie durch hohe Raum-Zeit-Ausbeuten, konstante Produktqualitäten sowie geringere Rüstzeiten überzeugen, konnten sich kontinuierliche Prozesse für die biotechnologische Produktion von Pharmazeutika bislang nur sehr vereinzelt durchsetzen. Dies ist vor allem in einer erhöhten Komplexität der Verfahrensführung, einer gesteigerten Kontaminationsgefahr sowie strikten Regularien begründet. Zudem wird in biotechnologischen Prozessen meistens eine zusätzliche Apparatur zum Rückhalt von Zellen benötigt, um die Produktausbeute zu steigern und somit wirtschaftlich kompetitiv zu sein. Eine Verfahrensausführung zur kontinuierlichen biotechnologischen Produktion mit integrierter Produktabtrennung ist die gepulste Diafiltration. Bei diesem membran-basierten Zellrückhaltesystem wird das Membranmodul in die Kultivierungsflüssigkeit des Bioreaktors getaucht. Folglich verbleiben die Zellen in ihrer optimalen Umgebung und sind daher nur minimalen Scherkräften und keinen zusätzlichen Limitationen ausgesetzt. Über die getauchte Membran wird abwechselnd Produktlösung gewonnen und Medium zugeführt, so dass die mögliche Bildung einer Deckschicht auf der Membran reduziert wird. Die Etablierung der gepulsten Diafiltration sowie ihre Modifikation für verschiedene Anwendungsbereiche ist Gegenstand dieser Arbeit. Zunächst wurde das Membranmodul der gepulsten Diafiltration bezüglich seiner Biokompatibilität untersucht. Da in der Literatur keine standardisierten Verfahren zur Untersuchung der Biokompatibilität von Kunststoffen beschrieben sind, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein solches Testverfahren entwickelt. Die Atmungsaktivität von Mikroorganismen wird bei diesem Biokompatibilitätstest in Abhängigkeit der Konzentration der verwendeten Kunststoffteile mittels der RAMOS Technologie (Respiration Activity Monitoring System) untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass 40 g L-1 Kabelbinder bzw. 4 – 10 g L-1 Polyamidschlauch inhibierend auf die Hefe Hansenula polymorpha wirken, da das toxische Monomer 1,8-Diazacyclo-tetradecane-2,7-dione bzw. der Weichmacher N-Butylbenzolsulfonamid aus den verwenden Kunststoffen auswäscht. Nach Gewährleistung der Biokompatibilität des Membranmoduls wurde die gepulste Diafiltration mit Fokus auf eine maximale Raum-Zeit-Ausbeute des Produktes sowie Langzeitstabilität des Filtrationsprozesses ausgelegt. Der gepulsten Diafiltration liegt eine Vier-Takt-Betriebsweise zugrunde, bei der zwischen Mediumszufuhr und Gewinnung der Produktlösung jeweils ein Zwischentakt zur Entleerung der Membran eingeführt worden ist. Durch gezielte Modifikation der Zwischentakte konnte verhindert werden, dass unverbrauchtes Medium in die Produktlösung gelangt. Das Resultat ist eine Steigerung der Raum-Zeit-Ausbeute sowie die Einsparung von Medium. Der Prozess gilt als langzeitstabil, wenn der kritische Flux, der zu einem Anstieg des Transmembrandrucks von 45 Pa min-1 führt, nicht überschritten wird. Mittels der Flux-Step Methode wurde der kritische Flux für die Kultivierung der Hefe H. polymorpha mit Syn6-Medium bzw. der tierischen Zelllinie CHO DG44 mit Power CHO 2 Medium zu 21 L m-2 h-1 bzw. 9 L m-2 h-1 bestimmt. Basierend auf diesen Daten wurde die benötige Membranfläche für eine langzeitstabile Anwendung beider Systeme abgeleitet. Eine erfolgreiche Demonstration der gepulsten Diafiltration ist sowohl für H. polymorpha, welche ein Antikörperfragment sezerniert, als auch für CHO Zellen, welche einen vollständigen Antikörper produzieren, in einen großen Durchflussratenbereich erfolgt. Im Vergleich zu einem konventionellen kontinuierlichen Prozess konnte die Antikörper-produktion mittels H. polymorpha verdreifacht werden. In diesem Versuch hat die Antikörpertransmission über 80% betragen und die Vitalität aller Zellen ist konstant größer als 85% gewesen. Die Anwendung der gepulsten Diafiltration für CHO Zellen erzielte Antikörpertransmissionen von 40 – 60%. Dies ist ein in der Literatur üblicher Wert für membranbasierte Zellrückhaltesysteme. Über 90% der CHO Zellen waren während der gesamten Anwendung der gepulsten Diafiltration vital. In beiden Fermentationen war der Transmembrandruck über einen Zeitraum von mehr als drei Wochen unkritisch, so dass die gepulste Diafiltration als langzeitstabiler, kontinuierlicher Prozesse betrachtet werden kann.Die Betriebsweise der gepulsten Diafiltration verursacht zeitlich heterogene Bedingungen, da Überschuss und Limitation der C-Quelle abwechselnd vorliegen. Dieser kurzzeitige Überschuss kann insbesondere bei Mikroorganismen im höheren Durchflussratenbereich zu kurzzeitigen Sauerstofflimitationen führen. Unter diesen Bedingungen produziert H. polymorpha Ethanol und die Produktausbeute wird verringert. Für die in dieser Arbeit untersuchten künstlich induzierten kurzzeitigen Sauerstofflimitationen hat die Konzentration des Antikörpers um 25% abgenommen. Eine sequentielle Verwendung von drei Membranen ermöglicht eine quasi kontinuierliche Medienzufuhr, so dass konstante und nahezu homogene Kultivierungsbedingungen ohne Bildung von Ethanol bei gleichbleibender Produkt-konzentration realisiert werden konnten. In dieser Arbeit hat sich die gepulste Diafiltration als robuster, langzeitstabiler und einfach umzusetzender Prozess zur in situ Produktgewinnung mit geringen Investmentkosten und minimalen Geräteaufwand erwiesen. Die Raum-Zeit-Ausbeute konnte deutlich gesteigert werden. Besonders vorteilhaft zeigte sich der Prozess bei scherempfindlichen Zellen und Organismen, welche Sauerstoff schnell verbrauchen.

Continuous processes are established in many industrial sectors such as steel, food or petrochemistry due to their cost effectiveness. Though they are characterized by their high space-time-yields, constant product quality as well as low downtimes, only a few continuous processes were implemented in the biotechnological pharmaceutical industry. This is caused by an increased complexity, a higher contamination risk and extensive regulations. Furthermore, in continuous biochemical engineered processes an additional cell retention system is required to achieve high product yields and to be economical competitive. In this regard, one option is the reverse-flow diafiltration, a membrane-based cell retention system. The membrane module is submerged in the bioreactor broth. Thus, cells are retained in their optimal environment minimizing shear stress and avoiding limitations such as oxygen. Over the submerged membrane product withdrawal and supply of fresh medium is alternated reducing a potential fouling layer. The objective of this work is to establish the reverse-flow diafiltration and modify its settings for different applications.At first, the membrane module was investigated regarding its biocompatibility. As there is no standardized analytical device or method to test biocompatibility, such a test method was developed within this work. The metabolic activity of various microorganisms was determined with the Respiration Activity MOnitoring Systems (RAMOS) as a function of the added amount of polymers commonly applied in biotechnology. Nylon and Polyamide 12, used in cable ties and tubing respectively, were found to delay and inhibit microbial growth. This is caused due to leaching of the plasticizer N-butylbenzenesulfonamide and the monomer 1,8-Diazacyclotetradecane-2,7-dione, respectively, from the polymers. A metabolic activity inhibition threshold concentration between 4 – 10 g L-1 Polyamide 12 tubing and approximately 40 g L-1 Nylon was determined for the cultivation of the yeast Hansenula polymorpha, respectively. After the membrane module was proven to be biocompatible, a configuration of reverse-flow diafiltration was conducted with focus on maximization of space-time-yield and long-term filtration stability. Maximization resulted in an improved 4-step mode of operation. Between each alternation of product solution withdrawal and supply of fresh medium one intermediate step empties the membrane. The two intermediate steps were adjusted and, thus, mixing of permeate and fresh medium could be prevented. Hence, fresh medium was saved while simultaneously dilution of the product solution was avoided. Long-term stability is achieved if the critical flux is not exceeded which is reached at a critical transmembrane pressure increase of 45 Pa min-1. Optimal flux ranges for this process could be identified by a systematic flux step method: The critical flux for the yeast Hansenula polymorpha cultured in minimal Syn6 medium and the mammalian cell line CHO DG44 cultured in Power CHO 2 medium is 21 L m-2 h-1 and 9 L m-2 h-1, respectively. The required membrane area for long-term stable processes is determined based on this data.Reverse-flow diafiltration was successfully applied over a broad range of dilution rates for both, the yeast H. polymorpha secreting a single-chain antibody and the mammalian cell line CHO DG44 secreting a full length antibody. The space-time-yield for H. polymorpha could be tripled in comparison to conventional continuous processes. Antibody transmission was above 80% and viability was constantly above 85% for this experiment. Application of reverse-flow diafiltration for CHO cells yields an antibody transmission between 40 and 60%, which is a typical value for membrane-based cell retention systems in literature. Viability was constantly above 90%. The transmembrane pressure was below the critical value for the culture time of over three weeks in both experiments indicating long-term stability. Thus, reverse-flow diafiltration proved to be an in situ cell retention device appropriate for cultivation of yeast and CHO cells. Conventional reverse-flow diafiltration pulses medium resulting in temporal heterogeneities. In microbial cultures especially the C-source alternates between depletion and excess, which leads to oscillations of the DOT signal. This effect is enforced at increased dilution rates. Artificially induced short-term oxygen limitations for H. polymorpha result in the formation of ethanol and a reduced product concentration of 25%. To overcome this cyclic problem, sequential operation of three membranes is introduced. Thus, quasi-continuous feeding is achieved reducing the oscillation of the DOT signal providing a nearly homogenous culture over time. In this thesis, reverse-flow diafiltration proved to be a fail-safe, long-term stable, easy applicable in situ product recovery process with low investment costs and minimal equipment requirements. Space-time-yields could be enhanced remarkably. RFD proved to be especially suitable for shear sensitive cells or organism prone to oxygen limitation.

OpenAccess:
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Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis

Format
online, print

Sprache
English

Externe Identnummern
HBZ: HT018606231

Interne Identnummern
RWTH-2015-01105
Datensatz-ID: 463902

Beteiligte Länder
Germany

 GO


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The record appears in these collections:
Document types > Theses > Ph.D. Theses
Faculty of Mechanical Engineering (Fac.4)
Publication server / Open Access
Public records
Publications database
416510

 Record created 2015-03-03, last modified 2023-10-27