Process Design Aspects for Small-Scale Fermentation Systems

Giese, Heiner; Büchs, Jochen; Bardow, André

doi:urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-007665

Process Design Aspects for Small-Scale Fermentation Systems

Giese, Heiner

2015

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Heiner Giese

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2015

UmfangX, 106 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Prüfungsjahr: 2014. - Publikationsjahr: 2015

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor) ; Bardow, André (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-11-27

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2015-007665
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/462911/files/462911.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Dissertation (Genormte SW) ; Ingenieurwissenschaften (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Filamentöse und biopolymerproduzierende Mikroorganismen gewinnen zunehmend an Bedeutung, da ihr Potential in Bezug auf weltweite Fragen der Nachhaltigkeit erkannt wurde. Ein ökonomisches industrielles Screening nach den besten mikrobiellen Produktionsstämmen und den geeignetsten Fermentationsbedingungen ist hierbei essentiell. Es ist bekannt, dass Filamente und Biopolymere die Viskosität von Fermentationslösungen beeinflussen, was zu einer Veränderung in der Sauerstoffversorgung der Mikroorgansimen führt. Der Einfluss der Viskosität auf den Sauerstofftransfer ist für viskose Fermentationen in Rührreaktoren gut dokumentiert. Über den gas/flüssig Sauerstofftransfer in viskosen Schüttelkolbenfermentationen ist allerdings sehr wenig bekannt. Gleichermaßen wurde auch die effektive Scherrate in Schüttelkolben bislang nicht systematisch untersucht, obwohl diese die vorherrschende Viskosität, das Mischen sowie den Massen- und Wärmetransport in viskosen Fermentationslösungen beeinflusst. Da unbekannte Sauerstofftransferraten und unbekannte effektive Scherraten das Risiko erhöhen, dass unter unvorteilhaften Bedingungen „gescreent“ oder produziert wird, wurden in dieser Arbeit vier Ziele verfolgt, die diese Wissenslücken adressieren.Erstens sollten Messungen und numerische Simulationen des Sauerstofftransfers in chemische und mikrobielle Modellflüssigkeiten durchgeführt und die Anwendbarkeit der weitverbreiteten Filmtheorie von Higbie untersucht werden. Hierbei wurde gezeigt, dass die Higbie’sche Filmtheorie nicht für Schüttelkolbenfermentationen mit einer Viskosität von bis zu 10 mPa·s anwendbar ist. Es konnte erstmalig beobachtet werden, dass sich die Sauerstofftransferkapazität OTRmax in Schüttelkolben – entgegen der Intuition – erhöht, wenn die Viskosität von 1 mPa·s auf 10 mPa·s steigt. Das ist gleichbedeutend mit einer verbesserten Sauerstoffversorgung für die Mikroorganismen. Des Weiteren wurde demonstriert, dass die OTRmax bei Viskositäten von bis zu 80 mPa·s kaum geringer ist als bei wasserähnlichen Viskositäten. Dies ist gegensätzlich zu Rührreaktoren, da sich die Sauerstoffversorgung hier auf bis zu 5% bei 80 mPa·s stetig verschlechtert. Zweitens sollte auf Basis des Buckingham’schen π-Theorems und experimenteller Daten eine erste Scherratenkorrelation für Schüttelkolben entwickelt werden, die für ein großes Spektrum an pseudo-plastischem Fließverhalten, Schüttelkolbengrößen und Schüttelbedingungen Gültigkeit besitzt. Es wurde festgestellt, dass Scherraten in Schüttelkolben unter üblichen Fermentationsbedingungen einen Bereich von 20 1/s bis 2000 1/s abdecken können. Die Anwendbarkeit der entwickelten Scherratenkorrelation wurde an drei verschiedenen Schüttelkolbenfermentationen demonstriert. Abhängig vom Fließverhalten der Fermentationsbrühe ist die effektive Scherrate im Kolben im Vergleich zu einem Rührreaktor mit gleichem Leistungseintrag mindestens 1.55 mal so groß. Dies kann bei üblichem Fließverhalten in einer bis zu 50% geringeren Viskosität im Schüttelkolben resultieren. Drittens sollte im Rahmen dieser Arbeit ein Mikrotiterplattenkonzept entwickelt werden, das das Überschwappen der rotierenden Flüssigkeit auch bei hohen Drehzahlen und Füllvolumina verhindert. Bislang sind geringe Füllvolumina pro Well erforderlich, um akzeptable Sauerstofftransferraten zu erzielen, was häufig im Gegeninteresse dazu steht, dass ausreichend Kulturflüssigkeit benötigt wird, um Offline-Analysen im Kontext eines Screening durchführen zu können. Mit einem Sulfit-System wurden erste Messungen der OTRmax in Prototypen des neuen Mikrotiterplattenkonzeptes durchgeführt und die erlangten Messdaten mit denen aus konventionellen Mikrotierplatten (MTP) verglichen. Hierbei konnte die vorteilhafte Anwendbarkeit des neuen Konzeptes für Bereiche, in denen konventionelle MTP überschwappen, klar aufgezeigt werden. Diese Bereiche hängen vom Plattenformat (96-well, 48-well oder 24-well) ab, da der Einfluss der Oberflächenspannung mit sinkendem Welldurchmesser steigt. Im Fall des 96-well Formates ist das neue Konzept gegenüber der konventionellen MTP nur bei sehr hohen Drehzahlen und großen Füllvolumina überlegen. Hingegen schwappen konventionelle 48-well MTP und 24-well MTP bereits bei moderaten Schüttelbedingen über, sodass das neue Konzept hier bereits bei geringeren Schüttelfrequenzen vorteilhaft ist. Um auch die Biokompatibilität sicherzustellen, wurde Escherichia coli zum direkten Vergleich im neuen Prototyp und in einer konventionellen MTP kultiviert. Neben der vorhandenen Biokompatibilität wurde hierbei außerdem gezeigt, dass Fermentationen im neuen Konzept durch das Erzielen höherer Sauerstofftransferraten verkürzt werden können. Zusammenfassend wurde also ein MTP-Konzept entwickelt, das sich besonders für Hochdurchsatzscreenings eignet, bei dem hohe Volumina an Überstand für Offline-Analysen benötigt werden. Viertens sollte ein Scale-down-Verfahren angewendet werden, das auf einem Sulfit-System basiert und zur Einstellung gleicher OTRmax-Werte in Mikrotiterplatten und Schüttelkolben geeignet ist. Generierte Sulfitdatensätze wurden verwendet, um Schüttelbedingungen zu identifizieren, die für den Modelorganismus Trichoderma reesei die gleiche Sauerstoffversorgung in Schüttelkolben und 24-well Mikrotiterplatten sicherstellen. In 24-well Mikrotiterplatten wurde die in einem industriellen Schüttelkolbenprotokoll erzielte OTRmax von 20 mmol/L/h mit folgenden Schüttelbedingungen erreicht: 1 mL Füllvolumen pro Well, 200 rpm Schüttelfrequenz und 50 mm Schütteldurchmesser. Mit diesen Schüttelbedingungen wurden nahezu identische Sauerstofftransferraten und Produktkonzentrationen in Schüttelkolben und 24-well Mikrotiterplatten als Funktion der Fermentationszeit gemessen. Das angewendete Sulfitverfahren stellt eine schnelle und genaue Möglichkeit dar, um durch das Scale-down eines etablierten Schüttelkolbenprotokolls in eine Mikrotiterplatte Hochdurchsatz zu erzielen. Die gewonnenen Erkenntnisse über den Sauerstofftransfer und die effektive Scherrate in viskosen Systemen sind wertvoll, um Unterschiede in Screening- und Produktionsergebnissen zu erklären. Konsistente Ergebnisse während verfahrenstechnisch fundierten Scale-up- und Scale-down-Prozessen ermöglichen schließlich eine ökonomische biotechnologische Prozessentwicklung.

Filamentous or biopolymer producing microorganisms are currently gaining importance due to their huge potential regarding worldwide sustainability issues. An economic industrial screening of these organisms is essential for determining the best producing microbial strains or fermentation conditions. It is known that filaments and biopolymers massively influence viscosity of the fermentation broth, thereby affecting the oxygen supply for microorganisms. In literature, the influence of viscosity is well documented for the oxygen transfer in stirred tank fermentations, however, little is known about the influence of viscosity on gas/liquid oxygen transfer in shake flask cultures. Even the effective shear rate in shake flasks was never systematically investigated, although it influences the apparent viscosity, mixing as well as mass and heat transfer. Since unknown oxygen transfer rates and unknown effective shear rates pose the risk of screening and producing under unfavorable conditions, this work addresses this lack of knowledge.Four objectives were pursued within this study. First, measurements and numerical simulations of the oxygen transfer in liquid films adhering on shake flask walls were conducted as a function of viscosity and film thickness. Thereby, the suitability of the widely applied film theory of Higbie was studied. It was demonstrated that Higbie’s film theory does not apply for cultivations which occur at viscosities up to 10 mPa·s. For the first time, it was experimentally shown that the maximum oxygen transfer capacity OTRmax counter-intuitively increases in shake flasks when viscosity is increased from 1 mPa·s to 10 mPa·s, leading to an improved oxygen supply for microorganisms. Additionally, the OTRmax at viscosities of up to 80 mPa·s is not significantly lower than the OTRmax at waterlike viscosities. This is contrary to stirred tanks, where the oxygen supply is steadily reduced to only 5% at 80 mPa·s. Second, a first shear rate correlation for shake flasks – valid for a wide range of pseudo-plastic flow behaviors, shake flask sizes and operating conditions – was developed as a function of viscosity on the basis of Buckingham’s π-theorem and experimental data. It was found that effective shear rates in shake flasks commonly cover a range from 20 1/s to 2000 1/s. The precise applicability of the developed shear rate correlation was demonstrated for three different shake flask fermentations. Depending on the broth’s flow behavior, the effective shear rate in shake flasks is at least 1.55 times higher than that in stirred tank reactors operated at the same volumetric power input, leading to a potentially 50% lower apparent viscosity in shake flasks. Third, a novel concept of microtiter plates (MTP) in 96-well, 48-well and 24-well format was developed preventing spill-out of the rotating liquid even at high shaking frequencies and high filling volumes. In spite of the fact that high filling volumes per well are often desirable for offline analytics during screening procedures, as yet, low filling volumes per well have to be adjusted to prevent spill-out and to overcome insufficient oxygen transfer in conventional MTPs. In prototypes of the newly developed MTP, preliminary measurements of the OTRmax were conducted using a sulfite system. With respect to the OTRmax, the advantages of the novel MTP could clearly be displayed for ranges of filling volume and shaking frequency where conventional MTPs spill out: Whereas extreme shaking conditions are needed for the novel 96-well type to reach a higher OTRmax compared to the conventional one, the novel 48-well and 24-well formats are already advantageous at moderate shaking conditions. This is due to the influence of the surface tension which becomes less dominant the larger the well diameter is. The biocompatibility of the novel MTP type was proven by Escherichia coli fermentations. Due to higher achievable oxygen transfer rates and, thus, faster C-source consumption compared to cultures in the conventional MTP, the new MTP even showed the potential of shortening the fermentation time. Hence, a suitable MTP concept was found for applications in high-throughput screenings where high sample volumes are required.Fourth, a scale-down was conducted requested by an industrial collaboration partner. To achieve time and cost efficient high-throughput for strain screening, an established shake flask protocol was scaled down into MTP. An approach based on an oxygen-consuming sulfite system was applied to ensure equal OTRmax-values in MTPs and shake flasks. Obtained sulfite datasets were used to identify operating conditions leading to the same oxygen supply for the model organism Trichoderma reesei in shake flasks and 24-well MTPs. For 24-well MTPs, the shake flask OTRmax of 20 mmol/L/h of the industrial protocol was obtained under the following optimal operating conditions: 1 mL filling volume per well, 200 rpm shaking frequency and 50 mm shaking diameter. With the identified operating conditions almost identical oxygen transfer rates and product concentrations were measured in shake flasks and 24-well MTP cultures as a function of fermentation time. The proposed sulfite approach is a fast and accurate means to scale-down established screening procedures into MTPs to achieve high-throughput. The obtained insights into oxygen transfer and effective shear rates in viscous systems are valuable for explaining existing deviations in screening and production results. Ultimately, by means of consistent scale-up and scale-down procedures, economic bioprocess development is facilitated with the results of this study.

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