Biofunktionalisierung von Biomaterialoberflächen mit poly-LacNAc und den Galektinen-1, -3 und -8

Rech, Claudia; Schwaneberg, Ulrich; Elling, Lothar

doi:5313

Biofunktionalisierung von Biomaterialoberflächen mit poly-LacNAc und den Galektinen-1, -3 und -8 = Biofunctionalization of biomaterial surfaces with poly-LacNAc and the galectins-1, -3 and -8

Rech, Claudia

2015

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Claudia Rech

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2015

Umfang239 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH* ; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-12-16

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-53134
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/462821/files/5313.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/462821/files/5313.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Galectine (Genormte SW) ; Galactosyltransferase (Genormte SW) ; Biomaterial (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; poly-LacNAc (frei) ; galectin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Ziel der Arbeit war es, eine modulare, künstliche extrazelluläre Matrix (ECM) mit poly-LacNAc, den humanen Galektinen-1, -3 und -8 und ECM-Glykoproteinen auf einer möglichen Biomaterialoberfläche aufzubauen. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Synthese von poly-LacNAc charakterisiert, optimiert und im mg Maßstab vergrößert. Dies beinhaltete die Optimierung der einzelnen Schritte von der Enzymexpression und aufreinigung über die Synthese bis zur Produktisolierung. Die Untersuchung der Eintopfsynthese der poly-LacNAc-Mischung bildete dabei den Hauptteil. Optimiert wurde das Verhältnis der Substrate und der Enzyme sowie deren Menge. Bei der Charakterisierung der Eintopfsynthese mit unterschiedlichen Enzymverhältnissen zeigten sich unerwartete Produktverteilungen, die durch eine Kinetik mit längerkettigen Substraten erklärt werden konnten: Die beta3GlcNAcT weist eine deutlich höhere Aktivität zum Tetrasaccharid auf. Die Synthese ausgehend von verschieden langen Akzeptorsubstraten zeigte eine Limitierung der Kettenlänge ab dem Nonasaccharid. In der semi-präparativen Synthese konnten poly-LacNAc-Strukturen erstmalig bis zu Hexadecasaccharid detektiert und bis zu Dodecasaccharid isoliert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die humanen Galektine-1, -3 und -8 im Hinblick auf ihren Einsatz zum Aufbau einer modularen, biomimetischen ECM untersucht. Außerdem wurden allgemeine proteinchemische Fragen wie Stabilität und Einfluss des His6-Tags diskutiert. Mit allen drei Galektinen (His6Gal-1C2S, His6Gal-3 und His6Gal-8) war es möglich, die ECM-Glykoproteine Laminin und Fibronektin an immobilisierten poly-LacNAc-Strukturen quer zu vernetzen. Dabei erfolgte die Bindung von His6Gal-1C2S bereits an das Disaccharid LacNAc auf Hydrogelen. Im Gegensatz dazu benötigen die Galektine-3 und -8 sowie das Modellgalektin CGL2 für eine optimale Bindung an poly-LacNAc auf Hydrogelen längerkettige Strukturen. Folglich ist die poly-LacNAc-Mischung für den ersten Aufbau ohne weitere spezifische Epitope die optimale Variante. Im dritten Teil wurde eine neuartige Screeningplattform mit Hydrogel in der Mikrotiterplatte entwickelt. Die Galektine konnten dadurch auf der letztendlichen Biomaterialoberfläche charakterisiert werden. Schlussendlich wurde die biomimetische Oberfläche als proof-of-principle mit Fibroblasten getestet. Auf den humanen Galektinen (gebunden an poly-LacNAc) zeigten sie dabei sehr gute Adhäsion und Wachstum. Dies ist auch auf der Oberfläche poly-LacNAc-Galektin-Fibronektin der Fall. Die genaueren Untersuchungen mit dem Modellgalektin CGL2 ließen vermuten, dass die biomimetische ECM im Vergleich zur Standardoberfläche und zu immobilisiertem Fibronektin deshalb adhäsiver und wachstumsfördernder wirkt, weil sie zum einen eine ECM bereits präsentiert und diese von den Zellen nicht aufgebaut werden muss. Zum anderen ist sie flexibler als immobilisiertes Fibronektin und kann von den adhärenten Zellen umgestaltet werden.

The aim of this work was to build up a modular, artificial extracellular matrix (ECM) with poly-LacNAc, the human galectins-1, -3 and -8 and ECM-glycoproteins on a potential biomaterial surface. First, the synthesis of poly-LacNAc was characterized, optimized and up-scaled. This included the optimization of the single steps from enzyme expression and purification over synthesis till product isolation. The characterization of the one-pot-synthesis of the poly-LacNAc mixture was prioritized. The ratio of the substrates and the enzymes as well as their amount was optimized. During characterization of one-pot-synthesis with different enzyme ratios, I observed an unexpected product distribution which could be explained by kinetic data with longer substrates: The enzyme beta3GlcNAcT has higher activity to the tetra-saccharide. The synthesis based on acceptor substrates of different length showed a limitation of chain length from nona-saccharid onwards. In semi-preparative synthesis, poly-LacNAc structures till hexadeca-saccharides were detected and poly-LacNAc till dodeca-saccharides were isolated for the first time. Second, the human galectins-1, -3 and -8 were characterized with respect to their use for building up a modular, biomimetic ECM. Furthermore, common proteinchemical questions like stability and influence of His-Tag were discussed. It was possible to cross-link the ECM-glycoproteins laminin and fibronectin with all three galectins (His6Gal-1C2S, His6Gal-3 und His6Gal-8) on immobilized poly-LacNAc structures. His6Gal-1C2S binds already on the di-saccharid LacNAc on hydrogels. In contrast, the galectins-3 and -8 as well as the model galectin CGL2 need longer chain length for optimal binding on poly-LacNAc on hydrogels. Consequently, the poly-LacNAc mixture is the optimum for the first construction without any specific epitopes. Third, a new screening system with hydrogel in the microtiterplate was developed. Consequently, the galectins could be characterized on the final biomaterial surface. Finally, the biomimetic surface was tested as proof-of-principle with fibroblasts. They showed very good adhesion and proliferation on the human galectins (bound on poly-LacNAc) and on the surface poly-LacNAc-galectin-fibronectin. Furthermore, the biomimetic ECM (with model galectin CGL2) is more adhesive in comparison to the standard surface TCPS (tissue culture plates poly styrene) and to immobilized fibronectin. I hypothesized that the already established ECM leads to an increase of adhesion and proliferation of fibroblasts because no build-up of ECM is necessary. Additionally, the biomimetic ECM is more flexible than immobilized fibronectin and can be rearranged by adherent cells.

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