Untersuchungen zu zellulären Effekten von Allicin, einem physiologisch aktiven Vertreter Reaktiver Schwefelspezies, aus Knoblauch (Allium sativum L.), in verschiedenen biologischen Systemen

Gruhlke, Martin Clemens Horst; Slusarenko, Alan

doi:33641

Untersuchungen zu zellulären Effekten von Allicin, einem physiologisch aktiven Vertreter Reaktiver Schwefelspezies, aus Knoblauch (Allium sativum L.), in verschiedenen biologischen Systemen = Investigation of the physiological active Reactive Sulfur Species Allicin from garlic (Allium sativum L.) in different biological systems

Gruhlke, Martin Clemens Horst (Author)^RWTH*

2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Martin Clemens Horst Gruhlke

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2014

Umfang259 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Zsfassung in dt. und engl. Sprache. - Druckausg.: Gruhlke, Martin Clemens Horst: Untersuchungen zu zellulären Effekten von Allicin, einem physiologisch aktiven Vertreter Reaktiver Schwefelspezies, aus Knoblauch (Allium sativum L.), in verschiedenen biologischen Systemen

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Slusarenko, Alan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-08-25

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-52336
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/459459/files/5233.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Knoblauch (Genormte SW) ; Allicin (Genormte SW) ; Oxidativer Stress (Genormte SW) ; Saccharomyces cerevisiae (Genormte SW) ; Ackerschmalwand (Genormte SW) ; Tierzelle (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Redox (frei) ; Reaktive Schwefelspezies (frei) ; reactive sulfur species (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Allicin ist die quantitativ bedeutendste antimikrobielle schwefelhaltige Substanz von frisch verletztem Knoblauchgewebe mit einer großen Bandbreite von antimikrobieller und biozider Wirkung. Allicin ist als Thiosulfinat ein Vertreter der Klasse der sogenannten „Reaktiven Schwefelspezies (RSS)“, die in der Lage sind, aufgrund ihrer redox-modulierenden Reaktivität gegenüber Thiolgruppen physiologische Bedingungen in biologischen Systemen zu verändern. Die dieser Arbeit zugrunde liegende Hypothese ist, dass die unterschiedlichen biologischen Aktivitäten in weiten Teilen von den redox-modulierenden Eigenschaften des Allicins abhängen. Eine wichtige Voraussetzung dieser Arbeit war die Etablierung eines effizienten Syntheseprotokolls von Allicin im Labor. Die biologische Wirkung von Allicin wurde auf Saccharomyces cerevisiae als Modellpilz, in Arabidopsis thaliana als Modellpflanze und in verschiedenen Säugetierzellkulturen getestet. Unter Zuhilfenahme eines enzymbasierten Assays wurde die Konzentration von reduziertem und oxidiertem Glutathion nach Behandlung mit Allicin ermittelt. Ferner wurden genetische und zellbiologische Methoden herangezogen, um die Induktion von Apoptose, Signalkomponenten und Resistenzmechanismen gegenüber Allicin zu ermitteln. In Arabidopsis wurden gezielt ausgewählte Mutanten getestet, um Faktoren zu entdecken, die bei der Antwort der Pflanze auf Allicin von Bedeutung sind. Ferner wurden verschiedene Säugetierzelllinien verwendet, um mit unterschiedlichen fluoreszenz- bzw. absorptionsbasierten Assays einen breiten Konzentrationsbereich von chemisch synthetisiertem Allicin bzw. Knoblauchsaft Informationen über Unterschiede zwischen den Zelllinien hinsichtlich Redoxstatus, Proliferationsinhibition und Induktion von (apoptotischem) Zelltod zu erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass Allicin das Verhältnis der absoluten Konzentration von oxidiertem und reduziertem Glutathion in Hefezellen verschiebt. Mithilfe von Mutanten konnte gezeigt werden, dass Glutathion tatsächlich bedeutsam ist für die Resistenz gegenüber Allicin. Durch cytologische und genetische Tests konnte gezeigt werden, dass Allicin in Hefe Apoptose induziert. Dabei scheint Actin ein Ziel der Wirkung von Allicin zu sein und nachfolgend der RAS/cAMP/Protein Kinase A (PKA)-Weg bedeutsam für sowohl Zelltod als auch Inhibition der Proliferation. Bedeutsam für die Resistenz gegenüber Allicin ist ein redoxsensitiver Transkriptionsfaktor, YAP1, dessen Aktivierung und funktionelle Notwendigkeit für die Resistenz gezeigt werden konnte. Phytotoxische Effekte von Allicin sind vielfältig und in besonderer Weise markant für oxidativen Stress typisches (lichtabhängiges) Ausbleichen von Pflanzen, Keimungsinhibition und die Behinderung des Wurzelwachstums. Auch hier ist Glutathion ein wichtiger Resistenzfaktor, was dadurch gezeigt werden konnte, dass in allen getesteten Assays die pad2 (enthält etwa 20% Glutathion im Vergleich zum Wildtyp)-Mutante markant sensitiver war als der Wildtyp. Auch in Säugetierzellkulturen führte die Behandlung mit chemisch synthetisiertem Allicin wie Knoblauchsaft zu einer Abnahme des reduzierten Glutathions. Effekte auf Zellproliferation, Zelltod und Apoptose-Induktion werden im Detail diskutiert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die redoxmodulierenden Eigenschaften von Allicin bedeutsam sind für seine breite Toxizität und dass die Induktion von Apoptose mit dieser Verschiebung korreliert. Die Identifikation des RAS/cAMP/Proteinkinase A (PKA)-Weges als wichtigem Faktor der allicininduzierten Apoptose in Hefe, dessen Beteiligung auch am allicininduzierten Zelltod in humanen Krebszelllinien gezeigt worden ist, qualifiziert das Hefemodell als ein geeignetes Modell für die mechanistische Untersuchung der Allicintoxizität. Erstmals wurde in dieser Arbeit eine ursachenorientierte Untersuchung phytotoxischer Effekte von Allicin durchgeführt. Die redox-korrelierte Inhibition der Zellproliferation und Verringerung der Überlebensrate in unterschiedlichen Säugetierzellkulturen gibt erste Evidenzen für das Potential von Allicin für eine medizinische Applikation, beispielsweise im Bereich der Chemotherapie.

Allicin is the quantitatively most important sulfur-containing volatile compound produced in damaged garlic tissue. Since allicin is a thiosulfinate, it acts as a ‘Reactive Sulfur Species’ (RSS) which oxidizes thiols under physiological conditions and thus has redox-modulating activity. The central hypothesis reported in this thesis is that the redox-modulatory properties are important for the biological activity of allicin. An important prerequisite of this project was to establish an efficient synthesis-protocol for allicin. Allicin’s effects were studied in Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast, a model fungus), Arabidopsis thaliana (model plant) and various mammalian cell lines. Changes in the absolute concentrations of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) after allicin treatment were determined using the glutathione reductase recycling assay. Mutants and cell-biological methods were used to study the induction of apoptosis and the role of signalling components that contribute to the resistance or susceptibility of yeast cells to allicin. Also in Arabidopsis a mutant-based approach was used to identify putative factors that contribute to the response of plants to allicin. In mammalian cell cultures, changes in redox status, cell proliferation and induction of (apoptotic) cell death were followed upon treatment with either synthetic allicin or garlic juice using standard staining assays. Allicin decreased the total concentration of the GSH in the glutathione pool and increased the proportion of GSSG in yeast cells. Furthermore, mutants in glutathione metabolism were hypersensitive to allicin. Actin was shown to be a target for allicin und the subsequent RAS/cAMP/Protein Kinase A (PKA) signalling route is important for allicin-induced cell death as well as inhibition of cell proliferation in yeast. The redox-sensitive transcription factor YAP1, which coordinates the oxidative stress response in yeast, was activated by sub-lethal doses of allicin shown both by localization studies and expression of a YAP1-target gene and is necessary for full resistance. Various phytotoxic effects of allicin were observed, e.g. light-dependent bleaching which is typical for oxidative stress, inhibition of seed germination und root development. Furthermore, GSH is important in resistance as illustrated by the enhanced sensitivity of the pad2 mutant (20% of wt GSH). In mammalian cell lines, treatment with synthetic allicin or garlic juice, lead to an increase in oxidation of the glutathione pool. Effects of chemically synthesized allicin or garlic juice on cell proliferation, viability and apoptosis induction and correlation to the redox-status will be discussed in detail. The data presented in this thesis show that the effects of allicin on cellular redox-conditions are important for its toxicity und correlate with the induction of apoptosis in yeast. The identification of the RAS/cAMP/PKA pathway that previously was shown for allicin-induced apoptosis in human cancer cells, validates the yeast model for mechanistic studies of the molecular basis of allicin’s toxicity. Phytotoxic effects of allicin were investigated for the first time und show that allicin is suitable model substance to study the impact of Reactive Sulfur Species (RSS) in plants. The redox-correlated effects on different mammalian cell-cultures provide evidences for a medical application potential.

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