Analyzing the fluxome of P. chrysogenum in an industrial environment : workflows for 13 C metabolic flux analysis in complex systems

Niedenführ, Sebastian; Wiechert, Wolfgang

doi:999910364135

Analyzing the fluxome of P. chrysogenum in an industrial environment : workflows for 13 C metabolic flux analysis in complex systems = Die Analyze des Fluxoms von P. chrysogenum in einem industriellem Umfeld : Workflows für die 13C metabolische Stoffflussanalyse in komplexen Systemen

Niedenführ, Sebastian (Author)

2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Sebastian Niedenführ

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2014

UmfangXXIV, 301 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2014-03-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-51937
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/444995/files/5193.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Computational Systems Biotechnology (FZ Jülich) (420410)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biotechnologie (Genormte SW) ; Penicillium chrysogenum (Genormte SW) ; Ingenieurwissenschaften (frei) ; Penicillium chrysogenum (frei) ; 13C metabolische Stoffflussanalyse (frei) ; Fluxom (frei) ; Systembiotechnologie (frei) ; 13C metabolic flux analysis (frei) ; fluxome (frei) ; systems biotechnology (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Metabolic Engineering ist eine gerichtete und wissensbasierte Methode, um die Produktionseigenschaften von Mikroorganismen zu verbessern. Sie zielt darauf ab, die Produktbildung der Mikroorganismen zu erhöhen, um ökonomische Produktionsprozesse zu schaffen. Das Fluxom, die Gesamtheit metabolischer Reaktionsraten, des Mikroorganismus wird durch mathematische Modellierung abgebildet. Das leistungsfähigste Werkzeuge der Fluxomanalyse, die 13C metabolische Stoffflussanalyse (13C-MFA), verwendet isotopisch markierte Substrate zur Kultivierung von Mikroorganismen. Die nach der Aufnahme und metabolischen Umsetzung entstehende Markierungsmuster in den Metaboliten werden durch hoch präzise Messapparate (zum Beispiel Massenspektrometer) quantifiziert. Aus diesen Messungen können die intrazellulären Reaktionsraten abgeschätzt werden. Die vorgelegte Arbeit befasst sich mit der 13C-MFA in komplexen Systemen. Dazu wurde P. chrysogenum BCB1 verwendet und unter industriellen Bedingungen die Bildung des Antibiotikums von Penicillin V untersucht. “Komplex” bezeichnet hier nicht nur das Wachstumsverhalten von P. chrysogenum, sondern auch die komplexe Nebenproduktbildung und Kompartimentierung des Metabolismus. Zudem zielt “komplex” auf die Übertragung der 13C-MFA von einer wissenschaftlichen Anwendung unter idealen Bedingungen zu einem industriellen Standard ab. Aus diesem Grund werden Voraussetzung und Annahmen für die Durchführung der Technik diskutiert und die notwendigen Anpassungen für den Einsatz im industriellen Umfeld beschrieben. Um gesicherte Erkenntnis über den Organismus zu erlangen, wird der Arbeitsablauf zur Durchführung der 13C-MFA vorgestellt. Durch die Untersuchungen werden die Defizite und Limitierungen der Technik aufgedeckt. Zuerst wurde die Technik in Chemostat Experimenten etabliert und auf Fed-batch Kultivierungen nahe am industriellen Prozess übertragen. Als Resultat liegen erstmals Stoffflusskarten unter diesen Prozessbedingungen vor. Die beiden Prozesse wurden mittels kinetischer Modellierung abgebildet um extrazelluläre Raten für die 13C-MFA abzuschätzen. Um die 13C-MFA anwenden zu können, mussten die zeitaufgelösten Markierungsanreicherungen extrapoliert und um die natürliche Markierung korrigiert werden. In der Arbeit wurden Toolboxen zur nichtlinearen Regression und globalen Sensitivitätsanalyse entwickelt. Großskalige metabolische Modelle wurden für P. chrysogenum aufgebaut, wobei experimentelle Daten und Datenbanken, sowie Literatur-Quellen, zum Einsatz kamen. Stammspezifische Messungen der Biomassezusammensetzung wurden in das Modell integriert. Um die Modelle auf ihre Anwendbarkeit zur Flussschätzung zu prüfen, wurde erstmals eine globale Sensitivitätsanalyse für die 13C-MFA durchgeführt. Zudem wurde diese Technik auf die zuvor beschriebenen Bioprozesse angewendet um die intrazellulären Reaktionsraten zu berechnen. Die erhaltenen, statistisch hochaufgelösten, Stoffflusskarten wurden weiter verbessert durch den Einsatz gezielter Versuchsplanung. Dazu wurden die konventionellen Versuchsplanungstechniken um die optimale Planung von sequentiellen Experimenten und Mehrzieloptimierung erweitert. Durch letzteres konnten optimale, und dennoch ökonomische, Versuche geplant und gleichzeitig die Nachteile konventioneller Techniken vermieden werden. Die Interpretation der generierten Stoffflusskarten zeigte, dass neben der Penicillinproduktion das Wachstum einen größeren Einfluss auf den oxidativen Pentosephosphatweg besitzt als bisher in der Literatur diskutiert. Dies führt zu einer sorgfältigen Ausbalancierung von Wachstum im Produktionsprozess und der gleichzeitigen Stammoptimierung.

Metabolic engineering is a targeted and knowledge-based approach to improve production capabilities of microorganisms. It aims at increasing metabolic reaction rates towards product formation to obtain economic production processes. The fluxome, i.e. the computation of all metabolic reaction rates, is one cornerstone of metabolic engineering. For fluxomics, the study of intracellular reaction rates, several methods have been established. The most powerful one, C-metabolic flux analysis (13C-MFA), uses isotopically labeled substrates which are fed to cells. Emerging labeling patterns in the synthesized metabolites are measured by high-precision measurement devices like mass spectrometry. From the measured labeling pattern, the intracellular reaction rates can be estimated by mathematical modeling. The present work faces 13C-MFA of complex systems. The non-model organism P.chrysogenum strain BCB1 is investigated in industrial environment with special focus on penicillin V production. The term “complex” is not only referring to the growth behavior of P.chrysogenum, but also includes side-product formation and compartmentalization of metabolism. This thesis aims at the transfer of 13C-MFA from a scientific application in a nearly ideal environment to an industrial standard. For this reason, the prerequisites needed and compromises made for 13C-MFA work-flow are thoroughly discussed and adaption of the industrial process is highlighted. To systematically gain knowledge about the organism, the state-of-the-art work-flow for 13C-MFA is presented, pitfalls and limitations of the technique are revealed for a close-to-industrial context. The technology is established using chemostat experiments. In a second step, close-to-industrial fed-batch cultivations are investigated and the first quantitative flux map of P.chrysogenum for industrial process conditions is presented. Therefore, a kinetic model was implemented for the processes aiming at an accurate extracellular rate estimation. To apply 13C-MFA, stationary labeling patterns are derived from time resolved labeling data by extrapolation and correction for natural abundance. Large scale metabolic models for P.chrysogenum were built based on experimental, literature and database knowledge. Strain specific measurements of biomass compounds were introduced into the models. Using the constructed model, the first global sensitivity analysis was performed for 13C-MFA to evaluate its suitability for flux elucidation. Finally, 13C-MFA was conducted to gain knowledge about intracellular fluxes within P.chrysogenum BCB1 and experimental design was used to increase the information content of isotope labeling experiments. The conventional experimental design tools were extended by diversification-driven and multi-objective experimental design. The design space was explored and compared to single-objective applications. Thereby optimal, yet economic, experimental designs can be planed, fighting shortcomings of conventional techniques. From the results of the deduced flux maps, hints for strain and process development are derived. One major finding was that the flux in oxidative pentose phosphate pathway is strongly influenced by the biomass formation, leading to carefully balanced growth in cultivations and strain optimization.

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