Towards the generation of recombinant and pharmaceutically relevant target proteins : phage display based isolation of specific scFv antibodies against metastasizing pancreatic carcinoma for clinical application and development of novel fluorescent reporter tags for on-line monitoring during target protein production

Siepert, Eva-Maria; Barth, Stefan

doi:999910336013

Towards the generation of recombinant and pharmaceutically relevant target proteins : phage display based isolation of specific scFv antibodies against metastasizing pancreatic carcinoma for clinical application and development of novel fluorescent reporter tags for on-line monitoring during target protein production = Über die Generierung rekombinanter und pharmazeutisch relevanter Zielproteine : die Phage-Display-basierte Isolierung spezifischer scFv-Antikörper zur klinischen Anwendung gegen das metastasierende Pankreaskarzinom und die Entwicklung eines neuartigen fluoreszierenden Reportertags zum Online-Monitoring der Produktion eines Zielproteins

Siepert, Eva-Maria (Author)

2013 & 2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Eva-Maria Siepert

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangV, 195 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Prüfungsjahr: 2013. - Publikationsjahr: 2014

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Barth, Stefan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-11-22

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-48865
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/229505/files/4886.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Angewandte Medizintechnik (811001-1)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Bauchspeicheldrüsenkrebs (Genormte SW) ; Metastase (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Online-Monitoring (frei) ; Phage-Display-Technologie scFv (frei) ; metastasierendes Pankreaskarzinom (frei) ; phage display technology (frei) ; metastasizing pancreatic carcinoma (frei) ; on-line monitoring (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Pankreaskarzinom (PK) ist eine aggressive Krebsart, die sich durch ihr hohes Potential zur Metastasierung sowie eine schlechte Prognose auszeichnet. Ein asymptotischer Verlauf im Frühstadium, sowie der Mangel an verlässlichen Diagnostika, verhindern oft eine Früherkennung vor der Tumorinvasion in das lokale Gewebe. Die operative Tumorentfernung, kombiniert mit dem Erstlinienchemotherapeutikum Gemcitabin und Strahlentherapie, stellen nur lebensverlängernde Maßnahmen dar. Aufgrund der hohen Resistenz gegen konventionelle Therapeutika und dem enormen Potential zur Metastasierung bleiben minimale Mikrometastasen zurück, die für eine äußerst hohe Rückfallrate verantwortlich sind. Im ersten Teil dieser Thesis stand daher die Entwicklung neuer tumorspezifischer single-chain Antikörperfragmente (scFv) im Vordergrund, die in zukünftigen Anwendungen sowohl als zytolytisches Therapeutikum in der adjuvanten Therapie des metastasierenden PKs, als auch in der molekularen Frühdiagnose Einsatz finden sollen. Mittels der Phage-Display-Technologie wurden aus den naiven humanen Tomlinsonbibliotheken I und J pankreasspezifische scFv-Phagen-Antikörper gegen unbekannte tumorassoziierte Antigene generiert. Diese hochspezifischen scFv-Phagen-Liganden wurden über eine zweistufige Panningstrategie isoliert, die aus einer Depletion auf humanen periphären mononuklearen Blutzellen mit anschließender Positivselektion auf der metastasierenden Pankreaskarzinomzelllinie L3.6pl bestand. Mittels monoklonalem Phagen-ELISA wurden 16 einzigartige L3.6pl-Binder identifiziert, und im Anschluss im eukaryotischen HEK293T-Expressionsystem als lösliche scFv-SNAP-tag Fusionsproteine hergestellt. Zusätzlich wurde der Klon 14.1(scFv)-SNAP, isoliert aus einer laboreigenen murinen immunisierten Phagenbibliothek, in den Expression- und Charakterisierungsprozess integriert. Die Bindespezifität und Kreuzreaktivität von neun IMAC-gereinigten scFv-SNAP Proteinen wurde mittels eines löslichen Protein-ELISAs und der Durchflußzytometrie analysiert. Bei vier dieser Klone konnte im OPERA-System überdies eine Internalisierung nachgewiesen werden. Alle positiven Kandidaten sind klinisch relevante pankreasspezifische scFvs mit Potential zur zielgerichteten Eliminierung residualer Krebszellen und Therapie, sowie vielversprechend im Hinblick auf die in-vivo-Diagnostik und Theranostik. Für die Produktion von rekombinanten pharmazeutischen Proteinen im Großmaßstab wurden hocheffiziente Screeningmethoden entwickelt, um die optimalen Kultivierungsbedingungen für bakterielles Wachstum und Produktformierung zu charakterisieren. Mikrotiterplatten (MTPs), in Kombination mit Messystemen wie dem BioLector®, dienen im Labormaßstab zur nicht invasiven Online-Dokumentation der Produktformierung von kontinuierlich geschüttelten mikrobiellen Kulturen. Konventionelle Reporterproteine für die Online-Messung, z.B. GFP und seine Derivate oder Flavinmononukleotid-basierte fluoreszierende Proteine, besitzen ein hohes Molekulargewicht welches den Wirtsorganismus negativ beeinflusst. Zusätzlich ist die Reifung der Fluorophore von GFP in hohem Maße abhängig von der Sauerstoffsättigung. Aufgrund der Nachteile der konventionellen Reporterproteine, wurden im zweiten Teil dieser Arbeit kurze optisch aktive Reportertags zur Online-Detektion entwickelt. Diese neuartigen Reportertags (W-tags) basieren auf der Autofluoreszenz der aromatischen Aminosäure Tryptophan. Mittels in silico-Modellierung wurden zwischen ein und fünf Tryptophanreste in die natürlich vorkommende Proteinschleife des Cold Shock Proteins (Bc Csp) integriert, so dass die ausgeglichene Ladung der Tryptophanreste auf der Außenseite präsentiert wurde. Alle fünf W-tags wurden genetisch an die Antikörperfragmente anti-CD-30 Ki-4(scFv) und anti-MucI M12(scFv) fusioniert, und im prokaryotischen pMT-Expressionssystem produziert. Die Produktfluoreszenz wurde während der Fermentation in MTPs online vermessen, gefolgt von einer Bindeanalyse im Durchflußzytometer. Die Tryptophanfluoreszenz nahm dabei entsprechend der Produktformierung zu, wobei für eine höhere Anzahl an Tryptopharesten ein stärkeres Signal gemessen wurde. Für die Konstrukte mit W1–W3 war eine Rückgewinnung möglich, während W4 und W5 aufgrund der hohen Hydrophobizität der akkumulierten Trytophanreste im Zellpellet verblieben. Mittels normaler und komparativer Durchflußzytometrie der W-tag Fusionsproteine auf L540cy-Zellen wurde die Bindespezifität der Konstrukte bestätigt, welche nicht beeinflusst wurde, obwohl W-tags mit mehr als einem Trytophanrest einen negativen Einfluss auf die Bindeaktivität und –affinität zeigten. Die neuen W-tags stellen eine verwendbare Alternative zur nicht invasiven Produktdokumentation von rekombinanten Proteinen dar, ohne die Nachteile der konventionellen Reporterproteine. Sie bieten die Möglichkeit für eine schnelle und qualitative Onlinemessung während der Produktion von pharmazeutisch relevanten Zielproteinen im Großmaßstab.

Pancreatic cancer is an aggressive type of neoplasia characterized by its high potential for metastasis with a most devastating prognosis. Initial stages are almost asymptomatic, thus preventing early detection before local tissue invasion due to the lack of reliable diagnostics. Surgical removal in combination with standard first-line chemotherapeutic Gemcitabine treatment and radiation-based therapy are merely life-prolonging options. High resistance towards conventional therapeutics and the huge metastasizing potential leaves minimal residual micrometastasis accountable for an enormously high relapse rate. Therefore, the first aim of this thesis was to develop novel tumor specific human single chain antibody fragments (scFv) for possible future application as cytolytic therapeutics for adjuvant treatment of metastasizing pancreatic cancer, as well as more efficient molecular tools for early diagnosis. Phage display technology was employed to generate pancreas-specific scFv-phage antibodies from the naïve human Tomlinson phage libraries I and J binding against unknown tumor-associated antigen. Highly specific scFv phage ligands were isolated in a two-step panning strategy via depletion on human peripheral blood mononuclear cells (PBMC), followed by a positive selection on the metastatic pancreatic cancer cell line L3.6pl. Monoclonal phage ELISA identified 16 unique L3.6pl positive scFvs, subsequently expressed in eukaryotic HEK293T cells as soluble scFv-SNAP-tag proteins. Additionally, clone 14.1(scFv) SNAP, originally isolated from a laboratory-own murine immunized phage display library, was included into the expression and characterization process. Analysis of binding specificity and cross-reactivity of nine IMAC purified scFv-SNAP proteins was performed by soluble protein ELISA and flow. Of these, four clones displayed internalizing properties during flow cytometric and OPERA-based internalization tests. All positive candidates are clinically relevant pancreatic carcinoma specific scFvs and may provide the prospect of a tumor targeted cancer therapy to eliminate residual cancer cells. Moreover, they are highly promising candidates for diagnostic in vivo imaging tools besides an additional application as theranostics. To produce recombinant pharmaceutically relevant proteins on large scale, highly efficient screening technologies have been developed to characterize optimum cultivation conditions for bacterial growth and production formation. Microtiter plates (MTPs), in combination with measurement systems such as the BioLector®, are a practical tool for non invasive on-line monitoring of product formation of continuously shaken microbial cultures on lab-scale. Conventional reporter proteins for on-line monitoring, such as GFP and its derivatives, or flavin mononucleotide-based fluorescent proteins, are very large which possibly imposes stress on the host organism. Additionally, GFP strongly depends on an oxygen saturated environment for fluorophore formation. To circumvent mentioned drawbacks of conventional reporter tags, short but still optically active reporter tag for on-line detection were designed in this thesis. These novel reporter tags (W-tags) are based on the auto fluorescence of the aromatic amino acid tryptophan. Using in silico techniques, between one and five tryptophan residues (W1–W5) were accumulated in the naturally occuring protein loop of the cold shock protein (Bc Csp), to have equilibrated charges with the tryptophan residues presented on the outer side of the loop. Genetic fusions of these five different W-tags (MW = 3.4 to 5.6 kDa) to the anti-CD30 Ki-4(scFv) as well as the anti-MucI M12(scFv) antibody fragment were produced in a prokaryotic pMT-expression system. Analysis of on-line product fluorescence intensity during fermentation in MTPs followed by molecular biological flow cytometric binding analysis showed that more tryptophan residues within a W-tag generated a stronger tryptophan fluorescence signal gaining intensity corresponding to product formation. Nevertheless, an increase in tryptophan residues also complicated concentration of W-tagged proteins in the cell lysate. Protein recovery was only possible for constructs W1–W3. W4 and W5 remained in the cell pellet due to highly hydrophobic properties of the accumulated tryptophan molecules. Normal and comparative flow cytometry of W-tagged Ki-4(scFv) proteins on L540cy cells, in combination with a Ki-4 full length antibody, confirmed that binding specificity was not influenced whereas W tags with more than one tryptophan residue seemed to have a negative effect on binding activity and affinity. Lacking the main drawbacks of conventional reporter proteins, the novel W tags are an applicable alternative during non-invasive monitoring of recombinant product formation. They present the possibility for rapid and qualitative on line measurement during large-scale production of pharmaceutically relevant target proteins.

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