Identifizierung und Validierung neuer DNA-Methylierungsbiomarker zur Früherkennung von Harnblasentumoren sowie Charakterisierung des putativen Tumorsuppressorgens ITIH5 für das Harnblasen- und Mammakarzinom

Rose, Michael; Dahl, Edgar

doi:33617

Identifizierung und Validierung neuer DNA-Methylierungsbiomarker zur Früherkennung von Harnblasentumoren sowie Charakterisierung des putativen Tumorsuppressorgens ITIH5 für das Harnblasen- und Mammakarzinom = Identification and validation of novel DNA methylation biomarkers for early bladder cancer detection and characterization of the putative tumor suppressor gene ITIH5 for bladder and breast cancer

Rose, Michael (Author)

2013 & 2014

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Michael Rose

ImpressumAachen 2013

UmfangXIV, 238 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Zsfassung in dt. und engl. Sprache. - Prüfungsjahr: 2013. - Publikationsjahr: 2014

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Dahl, Edgar (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-05-13

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-45736
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/229798/files/4573.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Pathologie (528001-2)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Onkologie (Genormte SW) ; Biomarker (Genormte SW) ; Tumorsuppressor-Gen (Genormte SW) ; Extrazelluläre Matrix (Genormte SW) ; Blasenkrebs (Genormte SW) ; Brustkrebs (Genormte SW) ; Methylierung (Genormte SW) ; Epigenetik (Genormte SW) ; Naturwissenschaften (frei) ; ITIH5 (frei) ; FoxM1 (frei) ; DNA methylation biomarker (frei) ; breast cancer (frei) ; bladder cancer (frei) ; tumor suppressor gene (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 500

Kurzfassung
Die Identifizierung molekularer Biomarker ist ein bedeutsames Ziel der modernen Medizin. Diese Herausforderung zeigt sich im besonderen Maße am Beispiel des Harnblasenkarzinoms (TCC), dessen Früherkennung mit derzeitig diagnostischen Standards nicht adäquat erreicht werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnten aus ursprünglich 29 Kandidatengenen zwei Loci, lokalisiert in den Promotorbereichen der Gene ECRG4 und ITIH5, als potentielle neue DNA-Methylierungsmarker zur Früherkennung von Harnblasenkarzinomen validiert werden. Bei kombinierter Anwendung erzielten diese Biomarker mittels Pyrosequenzierung in einer unabhängigen Urinkohorte (n=46) eine kumulative Sensitivität von 83,9% bei einer Spezifität von 100% (AUC: 0,924, P<0,001). Somit wurde keiner der gesunden Probanden fälschlicherweise als Falsch-Positiv deklariert, während die Wahrscheinlichkeit, bei Negativität des Tests an einem TCC erkrankt zu sein, bei 25% lag. Eine Diskriminierung zwischen Harnblasen- und Prostatakarzinomen war bei gleichbleibender Detektionsstärke (83,9%) durch einen geringen Spezifitätsverlust (95,0%) charakterisiert. Analog zur Problematik der Karzinom-Früherkennung hat das mangelnde Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen Defizite für die Therapieoptimierung zur Folge. Aufgrund dessen wurde die tumorbiologische Konsequenz der potentiellen epigenetischen Inaktivierung von ITIH5 für die Entstehung des humanen TCC erstmalig untersucht. ITIH5 kodiert für ein sezerniertes Protein, das an der Integrität der extrazellularen Matrix beteiligt ist. Initial durchgeführte mRNA-Expressionsanalysen belegten einen signifikanten ITIH5 Verlust in TCCs, wohingegen sich eine abundante Expression im gesunden Urothel zeigte. Folgende ITIH5-Proteinexpressionsanalysen bestätigten eine signifikante Herabregulation des ITIH5-Proteins in humanen TCC-Geweben. Zudem ergab sich eine hochsignifikante (P<0,001) Assoziation zwischen der ITIH5-Promotormethylierung und dem mRNA-Expressionsverlust. Die Induktion der ITIH5-mRNA-Expression mittels einer DNA-demethylierenden in vitro Behandlung humaner Krebszellen mit 5-Aza-2’-deoxycytidin und Trichostatin A untermauerte funktionell diese statistischen Assoziation. Zwecks Evaluierung der biologischen Bedeutung der ITIH5-Inaktivierung für das TCC wurde anschließend auf Basis eines ITIH5 überexprimierenden Zellkulturmodells das funktionelle Wirkungsspektrum in der papillären Tumorzelllinie RT112 untersucht. Eine forcierte ITIH5-Reexpression führte zu einer signifikanten Reduktion der migratorischen sowie kolonienbildenden Eigenschaften der RT112 Tumorzellen und erhärtet den mutmaßlich tumorsuppressiven Charakter von ITIH5 für das Urothelkarzinom. Es ist bekannt, dass eine Destruktion der ECM-Strukturen im Zuge der Tumorgenese im Wesentlichen eine frühe Metastasierung bedingen kann. In diesem Kontext lies sich aus publizierten, retrospektiven Studien im Mammakarzinom die Hypothese ableiten, dass ITIH5 eine mögliche Funktion als Metastasierungssuppressor im Brustkrebs zukommt. Darauf aufbauend sollte im letzten Teil dieser Arbeit eine detaillierte Charakterisierung der phänotypischen Auswirkungen einer ITIH5-Reexpression auf invasive MDA-MB-231 Brustkrebszellen erfolgen. Funktionelle in vitro Analysen bestätigten eine effektive Suppression progressiver Tumoreigenschaften durch ITIH5: Während die Zell-Matrix-Adhäsion auf Hyaluronsäure als Substrat in Abhängigkeit einer ITIH5-Expression signifikant erhöht war, hatte die Reexpression in den mesenchymalen MDA-MB-231 Brustkrebszellen eine drastische Inhibierung der motilen und invasiven Fähigkeiten zur Folge. Dieses ITIH5 assoziierte Verhalten ging mit einem Phänotypwechsel einher, der durch ein Wiederherstellen epithelialer Marker, wie z.B. DSP oder ZO-1, sowie einer Re-Organisation des Aktin-Zytoskeletts gekennzeichnet war. Ein in vivo Metastasierungsmodell belegte schließlich, dass ITIH5 exprimierende Mammakarzinomzellen im Vergleich zur Kontrollgruppe nach intravenöser Injektion in Balb/c Mäuse nahezu gänzlich die Bildung von Metastasen verfehlten (-95,5%; P<0,001). Als möglicher Regulator dieses Wirkungsfelds konnte eine zu ITIH5 inverse Proteinexpression des Transkriptionsfaktors FoxM1 in vitro und in vivo identifiziert werden, die mit einem Verlust der MMP9 mRNA-Expression in den Lungenmetastasen assoziiert war. Von klinischer Bedeutung erwies sich die Kohärenz der inversen ITIH5-FoxM1-Expressionsachse in primären Mammakarzinomen, die einen Risikofaktor für die Rezidiv-Wahrscheinlichkeit der Mammakarzinom-Patientinnen darstellte. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen die Genloci ECRG4 -ITIH5 als neues DNA-Methylierungsbiomarker Panel zur Früherkennung von Harnblasenkarzinomen zu etablieren. Darüber hinaus konnte ITIH5 als neues, putatives Tumorsuppressorgen des Typs II im Harnblasenkarzinom charakterisiert und seine Funktion als Metastasierungsbarriere für die maligne Progression des Mammakarzinoms erhärtet werden.

The identification and characterization of novel molecular biomarkers is an important oncological objective of the modern medicine. This clinical challenge is particularly emphasized by the example of bladder cancer, screening of which is currently not realizable in a suitable manner. In the line with the accumulating evidence suggesting that DNA methylation could serve as a putative cancer biomarker, one aim of this study was the identification of novel gene loci useful for early bladder cancer detection. In the present study, a three-step validation procedure was applied to derive from a pool of 29 candidate genes two genomic loci, localized in the promoter regions of the genes ECRG4 and ITIH5, that were characterized as putative early detection biomarkers for bladder cancer. As a combined “two-gene-panel”, these loci achieved a sensitivity of 83.9% and a specificity of 100% (AUC: 0.924, p<0.001) by using pyrosequencing in an independent patient urine cohort (n=46). Thus, none of the healthy controls was erroneously detected as disease, while in case of negativity the likelihood of an existent bladder tumor was 25%. The ability to discriminate between bladder and prostate cancer was characterized by a marginal decrease in specificity (95%) but with consistent sensitivity (83.9%). Besides the identification of novel DNA methylation markers, the understanding of tumor biological consequences of aberrantly expressed genes represents a fundamental prerequisite for the development of future cancer therapies. Therefore, the involvement of the epigenetically silenced ITIH5 gene in human bladder cancer was deciphered in detail for the first time. ITIH5 encodes an extracellular matrix protein, being involved in extracellular matrix integrity. Initially performed ITIH5 mRNA expression analyses revealed a significant expression loss in invasive bladder tumors, while abundant expression was determined in normal bladder tissues. Immunohistochemical analyses demonstrated that ITIH5 expression was clearly attributed to epithelial cells of the healthy urothelium, while ITIH5 protein reduction was found in bladder cancer tumors. In addition, promoter hypermethylation of ITIH5 was significantly associated with its mRNA loss in primary bladder cancer tissues. In contrast, in vitro DNA demethylation of bladder cancer cell lines by 5-aza-2’-deoxycytidine and trichostatin A resulted in a notable ITIH5 reexpression, therewith functionally underlining a causal association. In order to evaluate the biological consequence and relevance of ITIH5 downregulation for bladder cancer development and progression its function was analyzed using a gain-of-function in vitro model based on the papillary RT112 tumor cell line. Here, forced ITIH5 expression caused a significant reduction of motility and colony growth of cancer cells, which underscores a presumable tumor suppressive function of ITIH5 in bladder cancer progression. It is well known that dysfunction of the extracellular matrix and associated molecules during tumor progression promotes early metastasis. Retrospective studies already described the epigenetic inactivation of ITIH5 in human breast cancer, which predicted unfavorable prognosis and was associated with clinico-pathological correlates of metastasis. Therefore, it was hypothesized that ITIH5 function during breast tumorigenesis is mainly attributed to suppression of the malignant progression. On this basis, an in-depth functional characterization of the phenotypic effects of forced ITIH5 re-expression on breast cancer cells was accomplished by using stably ITIH5 transfected MDA-MB-231 breast cancer cells. In vitro ITIH5 re-expression enhanced cell-matrix adhesion and led to a suppression of motility and invasiveness. These findings were accompanied by a phenotype switch of the mesenchymal MDA-MB-231 cancer cells towards an epithelial cell differentiation, characterized by cytoskeleton re-organization as well as restoration of junctional components, such as DSP or ZO-1. In a xenograft metastasis assay performed in Balb/c mice, breast cancer cells with ITIH5 re-expression almost completely failed to form lung metastases (-95.5%; p<0.001). These effects may be attributed to ITIH5-associated protein reduction of the transcription factor FoxM1, which in turn led to diminished MMP9 mRNA expression. Of clinical significance, a direct coherence of ITIH5 and FoxM1 was further supported in breast cancer patient samples where the inverse expression axis of ITIH5 and FoxM1 significantly predicted decreased tumor relapse. In summary, the here presented study successfully identified and validated ECRG4-ITIH5 as a novel two-gene DNA methylation biomarker panel for early bladder cancer detection. It further proposed ITIH5 as a putative type II tumor suppressor gene in bladder cancer development. Finally, this study corroborated our current hypothesis of ITIH5 as a potential suppressive barrier for breast cancer metastasis.

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