Entwicklung und Anwendung von Methoden für einen frühen Nachweis der Flugbranderreger Ustilago nuda und U. tritici in Gerste und Weizen

Wunderle, Jan Ulrik; Slusarenko, Alan

doi:999910306086

Entwicklung und Anwendung von Methoden für einen frühen Nachweis der Flugbranderreger Ustilago nuda und U. tritici in Gerste und Weizen = Development and implementation of early detection methods of the loose smut pathogens Ustilago nuda and U. tritici in barley and wheat

Wunderle, Jan Ulrik (Author)

2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jan Ulrik Wunderle

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangVII, 124 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Slusarenko, Alan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-02-19

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-45061
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/211237/files/4506.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Getreidekrankheit (Genormte SW) ; Nachweis (Genormte SW) ; Samenbürtige phytopathogene Pilze (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Nachweisverfahren (frei) ; Diagnose von Pflanzenkrankheiten (frei) ; samenbürtige Pathogene (frei) ; Blüteninfektion (frei) ; cereal disease (frei) ; plant disease diagnosis (frei) ; seed-borne fungi (frei) ; floral infection (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Der Befall von Gerste (Hordeum vulgare) und Weizen (Triticum aestivum) mit Flugbrand (Erreger: Ustilago nuda bzw. U. tritici) wird erst mit dem Erscheinen der Brandähre sichtbar. Sowohl die Entwicklung von Saatgutbehandlungsmitteln zur Flugbrandbekämpfung als auch die Züchtung auf Flugbrandresistenz könnten beschleunigt werden, wenn es gelänge, den Flugbrandbefall schon zu einem frühen Zeitpunkt nachzuweisen und möglichst zu quantifizieren. Mit dem Ziel, solche Verfahren zu entwickeln und zu erproben, wurde in der vorliegenden Arbeit zunächst mittels Fluoreszenzmikroskopie die Entwicklung des Pilzes in seiner Wirtspflanze verfolgt. In mit dem Fluorophor Blankophor angefärbten Handschnitten konnte bereits wenige Tage nach Aussaat Mycel beobachtet werden, das in das Apikalmeristem und die Blattprimordien einwuchs. Zum 1-Knoten-Stadium war die Ährenanlage schon stark besiedelt, und auch in den Halmknoten war der Pilz regelmäßig vorhanden. Weiterhin war es möglich, den Pilz in der Pflanze mit einem auf polyklonalen Antikörpern basierenden DAS-ELISA zu detektieren. In Sommergerste konnte bereits zum 3-Blatt-Stadium (ca. 10-14 Tage nach Aussaat) der U. nuda-Proteingehalt im Bereich des Vegetationspunktes sicher quantifiziert und eine Vorhersage des späteren Ährenbefalls getroffen werden. Bei Winterweizen war eine hinreichend sichere Befallsvorhersage dagegen erst im 1-Knoten-Stadium möglich. Nach Anwendung wirksamer Saatgutbehandlungsverfahren (chemische Beizung mit Sedaxane oder Raxil [Wirkstoff: Tebuconazol] bzw. Warm- oder Heißwasserbehandlung) lagen die U. nuda-Proteingehalte meist unter 500 ng/ml und damit in einer ähnlichen Größenordnung wie in Pflanzen, die aus gesunden Körnern herangewachsen waren. Parallel durchgeführte mikroskopische Untersuchungen deuteten daraufhin, dass das Mycel in Abhängigkeit vom angewendeten Verfahren entweder schnell abstarb (Beizung mit Sedaxane) oder noch vorübergehend in einem geschädigten Zustand fortbestand (Beizung mit Tebuconazol, Heisswasserbehandlung). Nach Saatgutbehandlung mit Extrakten aus Rhabarberwurzel (Rheum rhabarberum) bzw. Pestwurz (Petasites officinales) wurden im 3-Blatt-Stadium und im 1-Knoten-Stadium teilweise geringere Gehalte an U. nuda- bzw. U. tritici-Protein gemessen als in den Kontrollen, was auf eine Aktivität dieser Mittel hinwies. Allerdings hatte die Behandlung keinen oder einen nur geringen Effekt auf das Auftreten von Flugbrandähren. Weiterhin wurde ein Protokoll für die spezifische Amplifikation und Quantifizierung von U. nuda- bzw. U. tritici-DNA (real-time PCR) etabliert. Dazu wurde aus befallenen Pflanzen DNA extrahiert und mit pilzspezifischen Primern amplifiziert. Auch mit dieser Methode war eine Flugbrand-Befallsprognose bereits zum 3-Blatt-Stadium möglich. Insgesamt bestand eine gute Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen der Mikroskopie, des DAS-ELISA und der real-time PCR, allerdings war Letztere um einen Faktor von 250 sensitiver als das immunologische Verfahren. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass die Entwicklung von Frühtestsystemen zur Vorhersage des Flugbrandbefalls mit verschiedenen Verfahren möglich ist. Für den routinemäßigen Einsatz sind jedoch noch Optimierungen notwendig, wie etwa im Falle des DAS-ELISA eine sicherere Festsetzung der U. nuda-Protein-Gehalte (Schwellenwerte), bei denen mit einem Ährenbefall gerechnet werden muss oder bei allen Verfahren die Verwendung von Saatgutposten, die trotz hoher Infektionsraten unvermindert gut keimen.

Infestation of barley (Hordeum vulgare) and wheat (Triticum aestivum) with loose smut (pathogen: Ustilago nuda and U. tritici, resp.) is not visible until the appearance of the smutted head. Both the development of seed treatment products for loose smut control and the breeding for loose smut resistance could be accelerated if it were possible to earlier detect and quantify an infestation with loose smut. In the present work the development of the fungus in its host plant was monitored by fluorescence microscopy with the aim to test and establish such methods. Mycelium which invaded the shoot apical meristem (SAM) and the leaf primordia could be observed in hand sections stained with the fluorophore Blankophor, within a few days after sowing. At the one node stage the ear primordia were already heavily affected and the fungus was regularly present in the nodes as well. Furthermore, with a polyclonal antibody-based DAS-ELISA it was possible to detect the fungus inside the host plant. U. nuda protein content in the area of the SAM could be reliably quantified in spring barley already at the three leaf stage (10-14 days after sowing), and future ear symptoms could be predicted. For winter wheat a sufficient prediction was not possible until the one node stage. After application of efficient seed treatments (chemical treatment with Sedaxane or Raxil [active ingredient: tebuconazole] and warm or hot water treatment, resp.) amounts of the U. nuda protein were generally below 500 ng/ml and thus in a similar range as in plants grown from healthy grains. Microscopic analyses performed in parallel suggested that the mycelium, depending on the method applied, died off rapidly (seed treatment with Sedaxane) or temporarily persisted in a damaged condition (seed treatment with tebuconazole, hot water treatment). After seed treatment with extracts of rhubarb (Rheum rhabarbarum) root or butterbur (Petasites officinales) at the three leaf and one node stage partially lower amounts of U. nuda resp. U. tritici protein were determined than in the controls, suggesting an activity of these agents. However, the treatment had no or only little effect on the incidence of smutted heads. Moreover, a protocol for specific amplification and quantification of U. nuda resp. U. tritici DNA (real-time PCR) was established. DNA was extracted from infected plants and amplified with fungus-specific primers. Also with this method a prediction of an infestation with loose smut was possible already at the three leaf stage. Overall, there were good matches concerning the results of microscopy, DAS-ELISA and real-time PCR. The latter, however, was more sensitive by a factor of 250 than the immunological approach. The results of this work showed that the development of early test systems for predicting loose smut infestation is possible with various methods, indeed. Though, for routine use optimizations are necessary, as in the case of DAS-ELISA, a safer assess of the U. nuda protein content (threshold), at which an ear infestation is to be expected or, when using all of the methods, the use of seed stocks that are germinating unabatedly well in spite of high infection rates.

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