Synthese von Oligosaccharid-Polyetherbausteinen für den Aufbau von neuartigen ultradünnen biofunktionalisierten PEG-Stern-Polymerschichten

Adamiak, Kathrin; Elling, Lothar

doi:31722

Synthese von Oligosaccharid-Polyetherbausteinen für den Aufbau von neuartigen ultradünnen biofunktionalisierten PEG-Stern-Polymerschichten = Synthesis of oligosaccharide-polyether building blocks for the setup of new ultra thin biofunctionalized PEG-star polymer layers

Adamiak, Kathrin (Author)

2012

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Kathrin Adamiak

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2012

Umfang197 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2011

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2011-11-16

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-40419
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/82901/files/4041.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biomaterial (Genormte SW) ; Galactosyltransferase (Genormte SW) ; Click-Chemie (Genormte SW) ; Galectine (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Poly-LacNAc (frei) ; Biomaterialien (frei) ; Klick-Reaktion (frei) ; Click-Reaktion (frei) ; Galektin (frei) ; biomaterials (frei) ; click reaction (frei) ; Galectin (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Ziel dieser Arbeit war der modularisierte Aufbau einer multivalenten Glykanpräsentation auf Biomaterialoberflächen. Über multifunktionelle Kopplermoleküle sollten zielgerichtet Oligosaccharide verankert und charakterisiert werden. Für dieses Ziel griffen verschiedene Arbeiten ineinander. Zunächst wurden LacNAc-Derivate synthetisiert, die am reduzierenden Ende eine Funktionalisierung trugen. Für diesen Syntheseschritt wurden unterschiedliche GlcNAc-Moleküle mit der His6-Propeptid-beta4GalT1 charakterisiert, welche sich besonders affin für hydrophobe Funktionalisierungen zeigte. Hinsichtlich der durchgeführten LacNAc Synthesen bedeutete dies eine optimale Eigenschaft. LacNAc-Derivate mit Azid-, Amino- und Propargyl-Funktionalisierung konnten erfolgreich im präparativen Maßstab synthetisiert, isoliert und verifiziert werden. Einzig das kombinierte Molekül aus Saccharid und einem bifunktionellen Koppler wies unzureichende kinetische Parameter auf, um für eine effiziente LacNAc Synthese in Frage zu kommen. Insgesamt konnte mit den Substraten GlcNAc-(CH2)6-Azid und GlcNAc-amino-tBoc je ca. 300 mg (0,6 mmol) LacNAc-Derivat synthetisiert werden, zusätzlich eigneten sich beide Substrate für die Herstellung neuartiger LacDiNAc-Strukturen über die Katalyse mit einer mutanten Form der beta4GalT (Y284L). Poly-LacNAc-Derivate wurden unter Einsatz von bis zu drei verschiedenen Enzymen mit GlcNAc-(CH2)6-Azid und GlcNAc-amino-tBoc über zwei Verfahren hergestellt: über den gut kalkulierbaren -aber aufwendigen- sukzessiven Syntheseprozess, oder über das ökonomischere Ein-Topf Syntheseverfahren. Dabei wurden im präparativen Maßstab Ausbeuten von > 90% erzielt. So konnte erstmalig die chemo-enzymatische Synthese von Azid- und Amino-funktionalisierten Poly-LacNAc Strukturen mit bis zu 10 Saccharid-Einheiten im präparativen Maßstab gezeigt werden. Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit bis zu 50 mg (50 micromol) pro Oligosaccharid für weitere Untersuchungen hergestellt. Im nächsten Schritt wurden verschiedene Methoden zur Immobilisierung der Poly-LacNAc Oligosaccharide in Mikrotiterplatten etabliert. So wurde ein acetylenfunktionalisierter Koppler, der zusätzlich eine geschützte Aminofunktion trug, mittels Klickreaktion an azidfunktionalisierte Oligosaccharide gekoppelt und an aminoreaktiven Oberflächen immobilisiert. Alternativ wurde zuerst Propargylamin immobilisiert und anschließend die Azidsaccharide daran geklickt. Für dieses System kamen kommerziell erhältliche Mikrotiterplatten und erstmals NCO-sP(EO-stat-PO)-Hydrogelschichten in der Mikrotiterplatte (Kooperation mit Dr. J. Groll, DWI am ITMC der RWTH Aachen) zum Einsatz. Zur funktionellen Analyse wurde entweder das Modell-Galektin His6CGL2, das humane Galektin His6Gal1, oder weiterhin kommerzielle Gal- oder GlcNAc-spezifische Lektine eingesetzt. Es zeigten sich qualitative Unterschiede zwischen den verschiedenen Oberflächen. Die Hydrogel-beschichteten und Saccharid-funktionalisierten Oberflächen lieferten überzeugende Ergebnisse im Vergleich zu den kommerziellen Referenzoberflächen. Weiterführend müssen die Beschichtungsprotokolle der Hydrogele jedoch verbessert werden. Das entwickelte Baukastensystem mit hoher Variabilität bietet einen neuartigen Ansatz, um gezielt Poly-LacNAc Strukturen zu immobilisieren. Auf dieser Arbeit basierend können multivalente Oberflächen durch Kombination der verschiedenen vorgestellten Methoden bearbeitet werden. Mit solchen multivalent funktionalisierten Hydrogelen würde man interaktive Biomaterialoberflächen erhalten, die spezifisch und molekular verstärkt Galektine sowie EZM Glykoproteine binden können. Damit könnte es beispielsweise möglich sein, die Adhäsion eines bestimmten Zelltyps an die Biomaterialoberfläche zu erzielen.

Aim of this work was to modularize the setup of a multivalent glycan presentation on biomaterial surfaces. Oligosaccharides should be anchored onto artificial surfaces via multifunctional coupling molecules with their subsequent characterisation. Different workpackages were combined to reach this goal. First, the LacNAc derivatives were synthesized, which had a functionalization at their reducing end. The synthesis step was performed and characterized with His6-propeptide-beta4GalT1, which proved to be particularly affine for hydrophobic functionalizations. LacNAc derivatives with azide-, amino-, and propargyl-functionalization were successfully synthezised in preparative scale, were isolated and their molecular structure was proven. An exception was the joint molecule of one azide saccharide and the bifunctional coupler. The LacNAc synthesis of this derivative did not show efficient kinetic velocities. Overall 300 mg (0,6 mmol) were synthezised of both, the LacNAc-(CH2)6-azide and the LacNAc-amino-tBoc derivatives. Furthermore, their corresponding GlcNAc substrates could be used for the synthesis of new LacDiNAc structures via catalysis with the mutant enzyme beta4GalT Y284L. Poly-LacNAc derivatives of GlcNAc-(CH2)6-azide and GlcNAc-amino-tBoc were synthezised with the combined use of up to three different enzymes and via two different synthesis strategies: Firstly, via the successive synthesis route, which is time consuming but has the advantage to be well organizable. Secondly, via the economic one-pot synthesis route. With this, yields of more than 90% could be reached in a preparative scale. Via this chemo-enzymatic preparative strategy the oligosaccharide derivatives poly-LacNAc-azide and -amino were achieved for the first time with up to 10 saccharide units. Of every oligosaccharide chain length were synthezised up to 50 mg (50 micromol) and prepared for further investigations. During the next step a variety of coupling methods was established to immobilize the poly-LacNAc oligosaccharides in microtiterplates. An acetylene equipped bifunctional coupler with a protected amino functional group was joined via click chemistry with azide bearing oligosaccharides and subsequently immobilized on aminoreactive surfaces. Alternatively it was possible to immobilize propargylamine at the surface and click it with the azide oligosaccharides. This system was established with commercially available microtiterplates and as well for the first time with NCO-sP(EO-stat-PO)-hydrogel layers (cooperation with Dr. J. Groll, DWI at ITMC of RWTH Aachen). The functional proof was given by the binding of either the model galectin His6CGL2, the human galectin His6Gal1, or of commercially available Gal- or GlcNAc-specific lectins. Qualitative differences of lectin binding could be detected between the different artificial surfaces. Surfaces equipped with hydrogel layers showed superior results compared to the standard reference surfaces. Further studies are necessary to optimize the coating procedure of the hydrogel layers. This building block system with its high variety is a new strategy to immobilize poly-LacNAc structures in a defined way. This system will be the basis for the establishment of multivalent oligosaccharide presentation via combination of different methods with the corresponding building blocks. In the future, biomaterial surfaces from multivalently functionalized hydrogels could interact specifically with galectins and further ECM glycoproteins. This will enable the adhesion of distinct cell types to biomaterial surfaces.

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