Optimizing microbial screenings using controlled-release systems

Scheidle, Marco; Büchs, Jochen

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-34271

Optimizing microbial screenings using controlled-release systems = Optimierung mikrobieller Screenings unter Verwendung von Wirkstofffreisetzungssystemen

Scheidle, Marco (Author)

2011

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Marco Scheidle

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2011

UmfangXIV, 78 Bl. : graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Zsfassung in engl. und dt. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-10-08

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-34271
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/63874/files/3427.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Screening (Genormte SW) ; High throughput screening (Genormte SW) ; Escherichia coli (Genormte SW) ; Hansenula polymorpha (Genormte SW) ; Kontrollierte Wirkstofffreisetzung (Genormte SW) ; Ingenieurwissenschaften (frei) ; Kleinkultur (frei) ; controlled-release systems (frei) ; microbial screening (frei) ; E. coli (frei) ; H. polymorpha (frei) ; high-throughput-screening (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Mikrobielle Screeningexperimente sind von großer Bedeutung für die Entwicklung biotechnologischer Prozesse, u.a. zur Auswahl des geeignetsten Mikroorganismus. Die Kultivierungsbedingungen in solchen Versuchen sollten den Bedingungen eines nachfolgenden Produktionsprozesses so gut wie möglich entsprechen. Dabei ist es absolut notwendig, vergleichbare Kultivierungsbedingungen in Kleinkulturscreenings und im großen Produktionsmaßstab zu verwenden, um sowohl eine aussagekräftige Analyse der Screeningexperimente treffen zu können, als auch ein erfolgreiches Scale-up zu realisieren. In dieser Arbeit werden verschiedene Facetten von Screeningexperimenten analysiert und Lösungen für die Optimierung in Hinsicht auf die vorher genannten, generellen Prinzipien untersucht. Ein zentraler Punkt zur Verbesserung der Vergleichbarkeit von Screeningexperimenten und Versuchen im Produktionsmaßstab ist, eine online Überwachung von Kultivierungsparametern sowohl im großen, als auch im kleinen Maßstab zu etablieren. Zur Weiterentwicklung der online im Schüttelkolben gemessenen Parameter während des Screenings und der Prozessentwicklung, wurden das „Respiration Activity Monitoring System“ (RAMOS) zur Messung von Atmungsaktivitäten und eine optische online pH-Messtechnik erfolgreich kombiniert. Zur Verbesserung der Vergleichbarkeit der verschiedenen Maßstäbe und um zuverlässiges Scale-up zu ermöglichen, müssen die Kultivierungsstrategien (z.B. der Verlauf der pH-Werte und der Substratkonzentrationen während der Kultivierung) im kleinen und im großen Maßstab vergleichbar sein. Aus diesen Gründen müssen die im großen Maßstab verwendete pH-Regelung und die Fed-batch-Betriebsweise für Screeningexperimente etabliert werden. Ein scheibenförmiges, polymerbasiertes Freisetzungssystem zur pH-Kontrolle in Schüttelkolben wurde in dieser Arbeit vorgestellt und verwendet. Es besteht aus einer Polymermatrix, in die Natriumcarbonat als pH-Stellmittel eingebettet wurde. Wird es im Kultivierungsmedium verwendet, setzt es das Natriumcarbonat in einer bestimmten Kinetik frei. Mit Hilfe dieses Freisetzungssystems war es möglich, die Pufferkonzentrationen in Escherichia coli Schüttelkolbenkultivierungen drastisch zu reduzieren. Dabei konnten die pH-Werte in einem Bereich gehalten werden, welcher für die Mikroorganismen physiologisch verträglich ist. Die pH-Werte in Kultivierungsmedien haben einen starken physiologischen Einfluss auf das mikrobielle Wachstum von Mikroorganismen, wobei insbesondere die Länge der Lag-Phase beeinflusst wird. Unterschiedliche Lagzeiten von Mikroorganismen haben wesentliche Auswirkungen auf die Ergebnisse von Screeningexperimenten. In dieser Arbeit wird demonstriert, dass Start-pH-Werte von Kultivierungsmedien enorme, stammspezifische Effekte auf die Lagzeit von E. coli Kulturen aufweisen. Für drei verschiedene E. coli Stämme konnte eine verkürzte Lagzeit bei niedrigeren Start-pH-Werten und für einen weiteren Stamm das gegenteilige Verhalten nachgewiesen werden. Dieser Parameter sollte daher bei der Auslegung von Produktionsprozessen, als auch von Screeningexperimenten berücksichtigt werde. Ein anderer analysierter Aspekt von Screeningexperimenten war das mikrobielle Wachstum von Vorkulturen. Es konnte demonstriert werden, dass Unterschiede im Inoculum von Vorkulturen in geschüttelten Bioreaktoren einen sehr großen Einfluss auf das Wachstum von Mikroorganismen haben und damit das rationale Design von Screeningprozessen maßgeblich beeinflussen. Aus diesem Grund wurde eine neue Technik zur Hochdurchsatz fed-batch Kultivierung von Vorkulturen präsentiert, mit der die Startparameter anschließender Screeningexperimente entsprechend angepasst werden können. Für die fed-batch Kultivierung in Schüttelkolben wurden glukosehaltige, polymerbasierte Freisetzungsscheiben verwendet. Für Anwendungen im Hochdurchsatz wurde eine neue Fed-batch-Mirkrotiterplatte vorgestellt, die am Boden von jedem Well ein immobilisiertes, polymerbasiertes Freisetzungssystem enthält. Diese neu entwickelte Methode zur fed-batch Vorkultivierung erlaubt das Angleichen des Wachstums aller gescreenten Stämme und generiert dadurch zuverlässigere Daten im anschließenden Screeningexperiment. Die erfolgreiche Anwendung dieser neuen Methode für die Vorkultivierung von E. coli und Hansenula polymorpha wird in dieser Arbeit dargestellt. Die vorgestellten Ergebnisse demonstrieren, wie wichtig eine sorgfältige Auswahl der Kultivierungsparameter für ein erfolgreiches mikrobielles Screening ist. Insbesondere die Kontrolle des pH-Wertes und die kontrollierte Freisetzung von Substraten sind relevant für verschiedene Aspekte von Screeningexperimenten. Die in dieser Arbeit entwickelten Systeme und Methoden verbessern signifikant das Screening von Mikroorganismen und ermöglichen ein sinnvolles Scale-up in den Produktionsmaßstab.

Microbial screening experiments are of utmost importance for developing biotechnological processes. The cultivation parameters for selecting the most suited microorganisms during these screening experiments should match the parameters for the subsequent production process as exact as possible. It is absolutely necessary, to apply comparable cultivation conditions in small-scale screenings and large-scale production processes, to ensure a meaningful analysis of the screening experiments as well as a successful scale-up of its results. In the presented work, different facets of screening processes were analyzed and solutions for their optimization regarding the aforementioned general principles were investigated. One key factor to improve the comparability of screening and production-scale experiments is to establish an online monitoring of cultivation parameters not only in large- but also in small-scale cultivations. To enhance the online information obtained during screening and process development in shake flasks, the RAMOS device for measuring respiration activities in shake flaks and a fiber optical, online pH-measurement technique were successfully combined. To further improve the comparability between the different scales and to enable a more reliable scale-up of experiments, the cultivation strategy (i.e. the progression of pH-value and substrate concentration during the cultivation) has to be comparable in small- and in large-scales. Thus, the in large-scale applied pH-control and fed-batch operational mode have to be adapted to small scale screening experiments. A disc-shaped polymer-based controlled-release system for pH-control in shake flasks was developed and applied in this thesis. It consists of a polymer matrix in which sodium carbonate as pH-control reagent is encased. When applied in cultivation media, this system releases sodium carbonate in pre-defined kinetics. With this system, it was possible to substantially reduce the buffer concentrations in shake flask cultivations of Escherichia coli, while the pH-values remained in the physiological range of microbial growth. An additional physiological effect of the pH-value is its influence on the growth behavior of the microorganisms and thereby especially on the duration of the lag-phase. Different lag times of the microorganisms considerably affect the outcome of screening processes. In this work it could be shown that the initial pH-value of the cultivation media has an enormous strain dependent effect on the lag time of E. coli cultures. For three E. coli strains a lower initial pH-value resulted in a shorter lag phase and one strain showed the opposite behavior. This parameter should be considered in the design of production processes as well as of screening experiments. Another analyzed facet of the screening process was the microbial growth in precultures. It could be demonstrated, that differences in the inoculum from precultures in shaken bioreactors have a tremendous effect on the microbial growth and thus on rational design of screening processes. Therefore, a new technique applying fed-batch mode in high-throughput precultivations for equalizing the initial parameters of subsequent screening experiments was introduced. For fed-batch cultivation in shake flasks, glucose containing polymer-based controlled-release discs were applied. For high-throughput applications a new fed-batch microtiter plate, with immobilized polymer-based controlled-release systems at the bottom of each well were presented. The newly developed fed-batch precultivation method enables equalized growth of all screened strains and will generate, therefore, more relevant and reliable data in subsequent main screening experiments. The feasibility of the presented concept has been proven for cultivations of E. coli and Hansenula polymorpha. All these results demonstrate the importance of choosing the correct cultivation parameters for a successful microbial screening. Especially the control of the pH-value and the controlled-release of substrate are important for several aspects of screening experiments. The systems and methodologies described in the current work significantly improve screening procedures and the meaningful analysis and scale-up of the obtained results.

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