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Domänenanalyse und Struktur-Aktivitäts-Beziehungen der proatherogenen MIF/Chemokinrezeptorkomplexe = Domain analysis and structure activity relationships of proatherogenic MIF/chemokine receptor complexes



Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Sandra Kraemer

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2011

UmfangVII, 138 S. : Ill., graph. Darst.


Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010


Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter


Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-06-01

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-33131
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/64435/files/3313.pdf

Einrichtungen

  1. Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Zellbiologie (513000-4)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Chemokine (Genormte SW) ; Makrophagen-Inhibitionsfaktor (Genormte SW) ; Rezeptor (Genormte SW) ; Arteriosklerose (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Struktur-Aktivitäts-Beziehung (frei) ; Atherosklerose (frei) ; Chemokines (frei) ; Macrophage migration inhibitory factor (frei) ; atherosclerosis (frei) ; chemokine receptor (frei) ; structure activity relationships (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das CLF-Chemokin MIF spielt eine entscheidende Rolle bei der atherogenen Leukozytenrekrutierung als „non-cognate“-Ligand der Chemokinrezeptoren CXCR2 und CXCR4. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte eine nähere molekulare Charakterisierung der MIF/CXCR2- und MIF/CXCR4-Interaktions-interface mit Fokus auf die beteiligten MIF-Sequenzbereiche. In dieser Dissertation konnten experimentelle Evidenzen erarbeitet werden, die die Hypothese untermauern, wonach MIF analog zur IL-8/CXCR2-Interaktion über ein two site binding model an CXCR2 bindet. Eine dieser Interaktionsdomänen stellt ein Motiv dar, welches in Anlehnung an das ELR-Motiv der CXC-Chemokine als pseudo-(E)LR bezeichnet wurde. Dieses setzt sich aus Arg-12 und Asp-45 zusammen, wobei sich die Aminosäuren in benachbarten loops des Zytokins befinden und das pseudo-(E)LR Motiv erst durch die räumliche Struktur gebildet wird. Durch Mutation des Motivs wurde dessen Beteiligung an der MIF/CXCR2-Bindung untersucht. Es wurden drei Mutanten generiert, R12A-MIF, D45A-MIF und R12A-D45A-MIF, welche sich wie WT-MIF exprimieren und aufreinigen ließen. Die strukturelle Integrität, sowie die Bioaktivität der mutierten MIF-Proteine konnte ebenfalls bestätigt werden. CXCR2-Bindungsstudien ergaben, dass alle drei Mutanten nur noch mit sehr geringer Bindungsaffinität an CXCR2 binden und sie waren auch nicht mehr in der Lage, den CXCR2-vermittelten Monozytenarrest in vitro zu bewirken. Das pseudo-(E)LR Motiv, insbesondere Arg-12, war auch an der Chemotaxis von Monozyten und beim Monozytenarrest in ex vivo durchspülten Maus-Karotiden beteiligt, welches durch den Aktivitätsverlust der Mutanten in den jeweiligen Versuchen gezeigt wurde. Das pseudo-(E)LR Motiv von MIF ist demnach maßgeblich an dessen atherogenen Wirkungen beteiligt. Mit Hilfe kurzer Peptide der extrazellulären Domänen von CXCR2, welche auf eine Membran synthetisiert wurden, konnte die Interaktion des pseudo-(E)LR Motivs mit den extrazellulären loops EL2 und EL3 nachgewiesen werden. Diese Bindung stellt somit die Site 2-Interaktion des two site binding models in Analogie zu IL 8/CXCR2 dar. Als zweite Interaktionsdomäne von MIF mit CXCR2 wurde in dieser Arbeit der N-like loop identifiziert. Es wurden kurze Peptide dieser flexiblen Region im Bereich der Aminosäuren 40-60 synthetisiert und als Kompetitor zu MIF in verschiedenen Versuchen eingesetzt. Die Peptide 40-49 und 47-56 erwiesen sich als potente MIF-Antagonisten und waren in der Lage, die MIF-Wirkung in allen Versuchen zu inhibieren. So konnten sie den MIF-induzierten Monozytenarrest im in vitro-Versuch blockieren und im Rezeptorkompetitions-Assay die MIF-Wirkung aufheben. Auch die MIF-induzierte Reduktion des cAMP-Spiegels über die Aktivierung von Gαi konnte mit den beiden Peptiden signifikant inhibiert werden. Die intraperitoneale Injektion von 47 56 führte zur signifikanten Reduktion des in vivo-Monozytenarrests in athero¬sklerotischen Maus-Karotiden. Auf der Rezeptorseite konnte mit Hilfe von Circular¬dichroismus-Studien und dem Peptidarray der N-Terminus von CXCR2 als weitere MIF-Bindungsstelle identifiziert werden. Demnach findet die Site 1-Interaktion des MIF/CXCR2-Komplexes über die Bindung des N-like loops von MIF mit dem N Terminus des Rezeptors über die Aminosäuren 47-56 statt. Die genaue Charakterisierung der MIF/CXCR2-Bindungsstellen hat aufgrund der proatherogenen Rolle von MIF durchaus therapeutische Relevanz. Das Peptid 47-56 war in der Lage die atherogene Leukozytenrekrutierung im LDLR-/--Mausmodell zu reduzieren und stellt demnach einen guten Ansatz zur Entwicklung von small molecule-Antagonisten dar. Da sich auch das pseudo-(E)LR Motiv als wichtiges Strukturmerkmal der MIF/CXCR2-Wechselwirkung herausgestellt hat, wäre die Kombination der beiden identifizierten Stellen zur Generierung eines MIF/CXCR2-Antagonisten ein weiterer vielversprechender Ansatz. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ebenfalls die MIF/CXCR4-Interaktion näher charakterisiert und es wurden Hinweise gesammelt, dass diese nach dem two site binding model ebenfalls über zwei Bindungsstellen verläuft. Es wurde sowohl die Interaktion von MIF mit dem N-Terminus von CXCR4 über Circulardichroismus- und Fluoreszenzspektroskopie als auch mit dessen EL2 mit Hilfe des Peptidarrays gezeigt. Des Weiteren wurden auf der Ligandenseite Hinweise zur Beteiligung von Asp 45 des pseudo-(E)LR Motivs und des N-like loops an der MIF/CXCR4-Interaktion gesammelt. Die Ergebnisse dieser Dissertation stellen einen wichtigen Schritt zur Aufklärung der Interaktions-Stellen zwischen MIF und den Chemokinrezeptoren CXCR2 und CXCR4 dar. Die molekulare Charakterisierung dieser MIF/CXCR2- und MIF/CXCR4-Komplexe ist für das weitere Verständnis der proatherogenen Rolle von MIF entscheidend und ermöglicht auch die Entwicklung therapeutischer Inhibitoren dieser Interaktionen.

Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is a pleiotropic cytokine and pivotal mediator of inflammatory diseases. MIF functions as a chemokine-like function (CLF) chemokine and plays an essential role in atherogenic leukocyte recruitment. This is based on its non-cognate interaction with the chemokine receptors CXCR2 and CXCR4. In my thesis, I focused on the molecular characterization of the MIF/CXCR2 and MIF/CXCR4 binding interface (‘binding domain analysis’) which I studied by biochemical and biophysical methods as well as in vitro and in vivo leukocyte recruitment models. Bioinformatic analysis indicated that MIF could have an ELR-like motif consisting of amino acids Arg-12 and Asp-45. These amino acids reside in neighboring loops in the MIF monomer and mimic an ELR motif in 3D. The motif was thus termed pseudo-(E)LR motif. Involvement of the pseudo-(E)LR motif in MIF’s chemokine-like functions was analyzed by generating the mutants R12A-MIF, D45A-MIF and R12A-D45A-MIF. The pseudo-(E)LR mutants could be expressed and purified like wildtype MIF. Overall structural integrity of the mutants as well as their bioactivity was confirmed by biochemical methods. Importantly, in a direct receptor competition assay, the mutants only showed a weak binding affinity to CXCR2. In addition, MIF’s in vitro monocyte recruitment function was abolished following mutation of the pseudo-(E)LR residues. Especially Arg-12 was also significantly involved in promoting the chemotaxis of monocytes and in enhancing monocyte arrest in ex vivo perfused mouse carotids. I concluded that the pseudo-(E)LR motif is essentially involved in MIF’s atherogenic effects. Using a peptide spot array in which small peptides of the extracellular domains of CXCR2 were synthesized onto a nitrocellulose membrane, interaction of the pseudo-ELR motif with extracellular loops (EL) 2 and 3 was demonstrated. In agreement with data available for CXCL8/CXCR2, this interaction could therefore represent site-2 binding in a putative two-site binding model for MIF/CXCR2 interactions. In fact, convincing evidence was gathered that MIF interacts with CXCR2 according to a two-site binding model. Accordingly, a second MIF/CXCR2 interaction site was identified and was termed N-like loop region in analogy to CXCL8. Short peptides representing this region ranging from amino acids 40-60 were synthesized and used as competitors to MIF in various assays. Peptides 40-49 and 47-56 proved to be potent MIF antagonists and were able to inhibit MIF effects in all assays. They blocked MIF-induced monocyte arrest under flow conditions in vitro and inhibited MIF/CXCR2 interactions in a receptor competition assay. In addition, MIF-triggered reduction of intracellular cAMP via activation of Gαi was also significantly blocked. Intraperitoneal injection of 47-56 resulted in a significant reduction of in vivo recruited monocytes in carotids of atherosclerotic mice. Circular dichroism (CD-) spectroscopy and peptide spot array analysis revealed the CXCR2 N-domain as a further MIF interaction site. The site 1 interaction therefore consists of the MIF N-like loop and the CXCR2 N-terminal region. Based on MIF’s proatherogenic function, a detailed characterization of the MIF/CXCR2 interaction site is of therapeutic relevance. Since peptide 47-56 significantly blocked atherogenic leukocyte recruitment in an in vivo mouse model it presents a good approach for developing small molecule antagonists. The structural basis of the MIF/CXCR4 interaction was also analyzed in this work. Again, I could obtain first evidence of two distinct receptor and MIF sites which interact according to a two-site binding model. Interaction between MIF and the CXCR4 N-domain was demonstrated using CD- and fluorescence spectroscopy and peptide spot array analysis revealed an interaction with EL2. While I found that the N-like loop of MIF supports an interaction with the N-domain of CXCR4, the MIF residues involved in site 2 MIF/CXCR4 interactions have remained unresolved. The results of my PhD thesis work represent an important step to structurally elucidate the MIF/CXCR2 and MIF/CXCR4 interaction interfaces. The molecular characterization of these MIF chemokine receptor complexes is essential to understand MIF’s pro-atherogenic role and to develop potential therapeutic inhibitors of this interaction.

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Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis

Format
online, print

Sprache
German

Interne Identnummern
RWTH-CONV-125747
Datensatz-ID: 64435

Beteiligte Länder
Germany

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The record appears in these collections:
Document types > Theses > Ph.D. Theses
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Faculty of Medicine (Fac.10)
Public records
513000\-4
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 Record created 2013-01-28, last modified 2022-04-22


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