Untersuchungen zur Analyse der O-Glykosylierung des IgA1-Moleküls im Krankheitsbild der IgA-Nephropathie

Keitel, Christine; Elling, Lothar

doi:910020488

Untersuchungen zur Analyse der O-Glykosylierung des IgA1-Moleküls im Krankheitsbild der IgA-Nephropathie = Analysis of the O-glycosylation of the IgA1 molecule in IgA nephropathy

Keitel, Christine (Author)

2010

VerantwortlichkeitsangabeChristine Keitel

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2010

Umfang235 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-03-23

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-32639
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51780/files/3263.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Glykane <N-> (Genormte SW) ; Kohlenhydrate (Genormte SW) ; Immunglobulin A (Genormte SW) ; Mesangiale Immunglobulin-A-Glomerulonephritis (Genormte SW) ; Galactosyltransferase (Genormte SW) ; Enzyme-linked immunosorbent assay (Genormte SW) ; Galactose (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; o-glycans (frei) ; iga nephropathy (frei) ; galactosyltransferase (frei) ; GalNAc (frei) ; ELISA (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
In dieser Arbeit fand eine umfassende und detailierte Charakterisierung eines Anti-Tn- und TF-Antikörpers und zweier Lektine, Helix aspersa Lektin und Jacalin im Hinblick auf ihre Wechselwirkung mit IgA1 O-Glykanen statt. Ziel war es, bereits existierende ELISA-Verfahren zur Detektion von untergalaktosyliertem IgA1 bei IgAN zu bewerten und neue Methoden zur Detektion zu entwickeln und ebenfalls zu bewerten. Die Antikörper und das Helix aspersa Lektin wurden genutzt, um Serum-IgA und aus dem Serum isoliertes IgA von IgAN-Patienten und Kontrollen (von gesunden Personen und Personen mit anderen Autoimmun- oder Nierenerkrankungen) zu untersuchen. Mit diesen Antikörpern und dem Lektin konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den IgAN-Patienten und den Kontrollgruppen festgestellt werden. Daraufhin wurden zwei neue Methoden zur Analyse der IgA1 O-Glykosylierung entwickelt. Im ersten Ansatz wurde versucht, die untergalaktosylierten freien GalNAc-Strukturen des IgA enzymatisch mit 3H-Galaktose radioaktiv zu markieren. Dazu wurden drei rekombinant exprimierte homologe Enzyme der Core 1 beta1,3 Galaktosyltransferase aus Homo sapiens, Drosophila melanogaster und E. coli, die Galaktose auf GalNAc übertragen, auf ihre Aktivität mit UDP-Galaktose als Donor und GalNAc-alpha-Benzyl und IgA als Akzeptor untersucht und detailiert charakterisiert. Die humane C1GalT ließ sich in E. coli nur in Incusion bodies exprimieren und zeigte auch nach Rückfaltung keine Aktivität. Auch die bC1GalT fiel bei Expression in E. coli zu einem großen Teil in Inclusion bodies an. Der Anteil an löslich exprimiertem Enzym und die volumetrische Aktivität konnten durch Fusion mit einem Propeptid einer Lipase aus Staphylococcus hyicus um mindestens das Zehnfache gesteigert werden. Die bC1GalT zeigte Aktivität mit UDP-Galaktose und GalNAc-alpha-Benzyl, nicht aber mit IgA. Die dC1GalT, exprimiert in Hi5 Insektenzellen, zeigte Aktivität mit UDP-Galaktose und GalNAc-alpha-Benzyl und war das einzige Enzym, das Galaktose auch auf IgA übertragen konnte. Das Problem bei der Analyse von IgA O-Glykanen ist die Mikroheterogenität: Jedes IgA1-Molekül besitzt ein individuelles Glykosylierungsmuster, dass nicht mit anderen IgA1-Molekülen übereinstimmen muss. Schwankungen im Galaktosegehalt erschweren so die Detektion von untergalaktosyliertem IgA. Daher wurde in einem zweiten Ansatz IgA aus den 40 Proben enzymatisch galaktosyliert. Der Galaktosegehalt der Probe vor und nach dem Galaktosetransfer wurde mit dem Helix aspersa Lektin und dem Tn- und TF-spezifischen Antikörper analysiert. So sollte für jede untersuchte Probe ein Standard geschaffen werden, der den maximal möglichen Galaktosegehalt angibt. Durch Vergleich der Proben vor und nach dem Galaktosetransfer sollten sich untergalaktosylierte Proben von normalen Proben abheben: Bei untergalaktosyliertem IgA sollte der Unterschied vor und nach Galaktosetransfer sehr groß sein. Bei Proben mit normalem Galaktosegehalt sollte der Unterschied gering sein. Leider zeigte sich auch mit dieser Untersuchungsmethode kein Unterschied zwischen IgAN-Patienten und Kontrollen. Daraufhin wurden untergalaktosylierte IgA1 O-Glykane in 40 Proben aus einem Kollektiv aus IgAN-Patienten und Kontrollen enzymatisch mit radioaktiver Galaktose markiert. Es zeigte sich nur ein geringer, nicht signifikanter Unterschied zwischen der Gruppe der 8 IgAN Patienten und 10 gesunden Kontrollpersonen. Diese Methode konnte nicht genutzt werden, um IgAN-Patienten unter einer gesunden Gruppe zu detektieren. Damit wurde zwar ein Ziel dieser Arbeit, die Entwicklung und Evaluierung von Analyseverfahren für IgA1 O-Glykane erreicht. Aber Antikörper und Lektine zeigten eine mangelhafte Spezifität für ihre jeweiligen Zielmoleküle und waren nicht für die Detektion von untergalaktosyliertem IgA geeignet. Es zeigte sich, das sowohl die hier neu entwickelten als auch schon bestehende Verfahren nicht sensitiv genug sind, um zur Diagnostik von IgAN verwendet zu werden.

In this work, the binding characteristics of a Tn and a TF-Antibody and two lectins, HAA from Helix aspersa and Jacalin towards IgA1 O-glycans were characterized in detail. The aim was to evaluate existing techniques for the detection of undergalactosylated IgA O-glycans in IgA nephropathy and to develop and analyse new detection methods. A set of serum samples from IgAN patients and controls was analyzed with the antibodies and the HAA lectin. However, no significant difference in the glycosylation profile could be found. A new technique for the detection of undergalactosylated IgA O-glycans was developed, that employs the enzymatic labeling of undergalactosylated glycans. Therefore, an enzyme that was able to transfer galactose onto free GalNAc sites on IgA1 had to be cloned. For this purpose, three homologous core 1 beta1,3 galactosyltransferases, that transfer galactose onto GalNAc from human, drosophila melanogaster and E. coli were recombinantly expressed and characterized in detail. The human enzyme was only formed in inclusion bodies and showed almost no activity. The bacterial enzyme was also formed in inclusion bodies. The solubility and activity of this enzyme could be greatly enhanced by expressing it as fusion protein with a propeptide from a lipase of staphylococcus hyicus. However, it was not able to transfer galactose onto IgA1 O-glycans. The enzyme from drosophila melanogaster showed a high activity when expressed in Hi5 insect cells and was the only one able to transfer galactose onto IgA1 O-glycans. In the first approach, unlabeled galactose was transferred by the drosophila C1 GalT onto free GalNAc moieties on IgA1. The binding profile of the Tn- and TF-antibody and the HAA lectin to IgA O-glycans was analyzed before and after the transfer of galactose. This should establish a homogenously galactosylated glycan standard. The comparison of the galactosylation profile before and after the transfer should show a great difference in undergalactosylated samples and a little difference in normally galactosylated samples and thus identify IgAN patients. Unfortunately, this method, also was not able to show a significant difference in the IgA glycosylation of IgAN patients and controls. This was greatly due to the poor specificity of the antibodies and lectin for their sugars. Secondly, free GalNAc moieties on IgA1 from the set of serum samples from IgAN patients and controls were labeled by the drosophila C1GalT with radioactive galactose (3H galactose). By this technique, no significant difference in the glycosylation pattern of IgAN patients and controls could be demonstrated. It seemed that enzyme kinetics prevented a complete labeling of all free GalNAc moieties. The aim to develop and evaluate different methods for the analysis of IgA1 O-glycans was achieved. However, none of the analysed methods was able to discriminate between IgAN patients and controls significantly. No method that was suitable as a sero-diagnostic test for IgAN could be developed.

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