Model-based experimental analysis of enzyme kinetics in aqueous-organic biphasic systems

Zavrel, Michael; Büchs, Jochen

doi:3116

Model-based experimental analysis of enzyme kinetics in aqueous-organic biphasic systems = Modellgestützte experimentelle Analyse von Enzymkinetiken in wässrig-organischen Zweiphasensystemen

Zavrel, Michael (Author)

2009

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Michael Zavrel

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2009

Umfang190, LX S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2009

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2009-10-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-31165
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51483/files/Zavrel_Michael.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Enzymkinetik (Genormte SW) ; Mathematische Modellierung (Genormte SW) ; Benzoin-Aldolase (Genormte SW) ; Zweiphasensystem (Genormte SW) ; Stoffübertragung (Genormte SW) ; Diffusion (Genormte SW) ; Hydrogel (Genormte SW) ; Immobilisiertes Enzym (Genormte SW) ; Thiamindiphosphat (Genormte SW) ; Ingenieurwissenschaften (frei) ; Carrageenan (frei) ; Alginat (frei) ; MEXA (frei) ; enzyme kinetics (frei) ; benzaldehyde lyase (frei) ; biphasic system (frei) ; mass transfer (frei) ; hydrogel beads (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Die Immobilisierung von Biokatalysatoren in Hydrogelkugeln, die in einem organischen Lösungsmittel suspendiert werden, ist eine vielversprechende Methode zur Produktion hydrophober Feinchemikalien. Die rationale Entwicklung solcher Immobilisate wird jedoch aufgrund der Überlagerung von Stofftransfer, Diffusion und Enzymreaktion erschwert. Deshalb wurde ein mechanistisches Kinetikmodell entwickelt, das diese Phänomene quantitativ beschreibt. Als Beispiel wurde die stereoselektive Carboligation zweier 3,5-Dimethoxybenzaldehyd-Moleküle (DMBA) zu (R)-3,3',5,5'-Tetramethoxybenzoin (TMB) mit Hilfe des Enzyms Benzaldehydlyase (BAL) untersucht. Dabei wird die BAL in Kappa-Carrageenan-Hydrogelkugeln immobilisiert, welche von einem organischen Lösungsmittel umgeben sind. Zunächst wurden die Phänomene Enzymreaktion, Stofftransfer und Diffusion separat untersucht. Die dabei entwickelten Kinetikmodelle wurden schrittweise miteinander kombiniert und schließlich zu einem Gesamtmodell zusammengefasst. Zur Untersuchung jedes einzelnen Reaktionssystems wurde die modellgestützte experimentelle Analyse (MEXA-Methode) angewendet, die a priori Simulationen, Sensitivitätsanalysen und optimale Versuchsplanung einschließt. Damit wird nicht nur die Entwicklung mechanistischer Kinetikmodelle, sondern auch die Entwicklung optimaler Messmethoden und -techniken unterstützt. Mit Hilfe der MEXA-Methode konnten sowohl die kinetischen Parameter mit hoher Genauigkeit geschätzt, als auch neue mechanistische Kinetikmodelle entwickelt werden, die mögliche Limitationen und Engpässe aufdecken. Beispielsweise wurde die Freisetzung des Produktes als geschwindigkeitsbestimmender Schritt im Katalysemechanismus der BAL identifiziert, während die Anlagerung der Substrate den katalytischen Engpass bei der Benzoylformiatdecarboxylase (BFD) darstellt. Darüber hinaus wurde ein neuer Ansatz zur Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels entwickelt und angewendet. Dieser zeigte, dass Methylisobutylketon hohe Produktausbeuten für die untersuchte Carboligation ermöglicht. Schließlich wurde die Diffusion der Reaktanden im Hydrogel untersucht. Hierbei ergaben a priori Simulationen, dass der Kugelmittelpunkt den optimalen Messort darstellt. Zudem konnte gezeigt werden, dass das Diffusionsgesetz nach Nernst und Planck anstelle des Fick'schen Gesetzes für die Modellierung der Diffusion dissoziierender Stoffe wie Propionsäure in Hydrogelkugeln angewendet werden muss. Die Kopplung dieser einzelnen Systeme offenbarte, dass eine modellgestützte Versuchsplanung notwendig ist um Limitationen zu vermeiden. Zum Beispiel, sind in einem gerührten Zweiphasensystem die enzymkinetischen Parameter nur dann identifizierbar, wenn die Reaktion geschwindigkeitsbestimmend ist. Außerdem sind hierbei Messungen sowohl in der wässrigen als auch organischen Phase erforderlich. Das Emulgieren des Zweiphasensystems sollte vermieden werden, da hierbei die Bildung von Aggregaten beobachtet wurde, die auf eine Grenzflächeninaktivierung der Enzyme hindeutet. Zuletzt wurden die erhaltenen Parameterwerte für das Gesamtsystem und für die gekoppelten Systeme mit denen aus den einzelnen Stoffsystemen verglichen. Dabei konnten für die enzymkinetischen Parameter, sowie für die Partitionskoeffizienten und für den Diffusionskoeffizienten des Substrats keine signifikanten Abhängigkeiten von den jeweiligen Stoffsystemen festgestellt werden. Allerdings weisen die Stofftransportkoeffizienten und der Diffusionskoeffizient des Produkts für die verschiedenen Stoffsysteme deutliche Unterschiede auf. Aus diesem Grund müssen zur optimalen Gestaltung von Enzymimmobilisaten die Modellparameter am Gesamtsystem bestimmt werden, wohingegen die Verwendung der in den einzelnen Stoffsystemen separat bestimmten Parameterwerte zu Fehlern führen kann. Mit Hilfe des entwickelten mechanistischen Modells für das gelstabilisierte Zweiphasensystem können Limitierungen durch Diffusion und Stofftransfer erkannt werden. Somit stellt dieses den Grundstein für die modellgestützte Entwicklung von Enzymimmobilisaten dar und ermöglicht die Optimierung derartiger Prozesse. Zu diesem Zweck kann das Modell an andere Reaktionen, Biokatalysatoren, Lösungsmittel und Geometrien der Immobilisate angepasst werden. Die durch die mechanistische Modellierung identifizierten Engpässe im Katalysemechanismus der Enzyme BAL und BFD werden sicherlich zur Entwicklung neuer und aktiverer Enzymvarianten beitragen.

Immobilization of biocatalysts in hydrogel beads which are suspended in organic solvents is a promising approach for the production of hydrophobic fine chemicals. Due to the superposition of mass transfer, diffusion, and enzyme reaction the rational design of such immobilizates is rather complex. For this reason, a mechanistic kinetic model considering all three phenomena was derived. As an example, the stereoselective carboligation of two 3,5-dimethoxy-benzaldehyde (DMBA) molecules to (R)-3,3',5,5'-tetramethoxy-benzoin (TMB) catalyzed by the enzyme benzaldehyde lyase (BAL) was investigated. BAL was immobilized in kappa-carrageenan hydrogel beads which were surrounded by an organic solvent. In the first step the phenomena enzyme reaction, mass transfer, and diffusion were studied in separate systems. Each system was individually investigated using the model-based experimental analysis (MEXA) approach including a priori simulations, sensitivity analysis, and optimal experimental design. This supports not only the development of mechanistic kinetic models, but also the determination of optimal measurement methods and the development of new experimental setups. Subsequently, the derived individual kinetic models were successively coupled and finally combined to a kinetic model for the gel-stabilized aqueous-organic biphasic reaction system. Using the MEXA approach, not only the kinetic parameters could be estimated with high precision, but also new mechanistic models could be developed which revealed possible limitations and bottlenecks. Accordingly, the release of the product was identified as rate-limiting step in the enzymatic mechanism of BAL, whereas the binding of the substrate turned out as the catalytic bottleneck in the mechanism of benzoylformate decarboxylase (BFD). Furthermore, a new approach for solvent selection was developed in order to optimize the extractable yield of the carboligation reaction in a biphasic system. Consequently, methyl-iso-butyl-ketone was chosen as organic solvent. The diffusion of the reactants in the hydrogel bead was investigated in the bead center, which was identified as the optimal measurement position using a priori simulations. It was demonstrated on the example of propionic acid that Nernst-Planck law is superior to Fick's law for modeling the diffusion of dissociating species in hydrogel beads. The coupling of the sub-systems revealed that sophisticated experimental design is crucial to avoid limitations due to the superposition of the phenomena. For instance, in a stirred biphasic system the enzyme kinetic parameters can only be identified if the reaction is rate-limiting. Furthermore, measurements in both phases are required. Emulsification should be avoided since the formation of aggregates was observed which indicates enzyme precipitation due to phase toxicity. Finally, the parameter estimates for the gel-stabilized aqueous-organic biphasic reaction system were compared to those obtained for the individual and coupled systems. No significant influence of the reaction system on the enzyme kinetic parameters, on the partition coefficients, and on the effective diffusion coefficient of the substrate could be observed. However, the estimated values of the mass transfer coefficients and the effective diffusion coefficient of the product deviated from system to system. Therefore, for the rational design of enzyme immobilizates the model parameters have to be determined using the complete system. Adopting the parameter estimates obtained from individual systems may lead to an incorrect model prediction and an inefficient process design. The derived mechanistic kinetic model for the gel-stabilized aqueous-organic system allows to detect limitations caused by diffusion or mass transfer, and paves the way for the rational design of enzyme immobilizates and for the optimization of such processes. It can easily be adapted to other reaction systems, biocatalysts, solvents, and geometries of immobilizates. Moreover, the identification of catalytic bottlenecks in the enzyme mechanisms of BAL and BFD will certainly support the development of new enzyme variants with enhanced activities.

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