Untersuchung von Zusammenhängen zwischen pflanzlichen Emissionen und pflanzeninternen Signalmolekülen und Enzymaktivitäten

Miebach, Marco; Slusarenko, Alan

doi:2980

Untersuchung von Zusammenhängen zwischen pflanzlichen Emissionen und pflanzeninternen Signalmolekülen und Enzymaktivitäten = Determination of connections between plant emissions and plant internal signal molecules and enzyme activities

Miebach, Marco (Author)

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Marco Miebach

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

Umfang123 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Slusarenko, Alan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-11-28

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-29804
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51264/files/Miebach_Marco.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Lipoxygenase <5-> (Genormte SW) ; Hydroperoxidlyase (Genormte SW) ; Lipoprotein-Lipase (Genormte SW) ; Fettsäurestoffwechsel (Genormte SW) ; Freie Fettsäuren (Genormte SW) ; Stressreaktion (Genormte SW) ; Stressresistenz (Genormte SW) ; Oxidativer Stress (Genormte SW) ; VOC <Ökologische Chemie> (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; lipoxygenase (frei) ; lipase (frei) ; hydroperoxide lyase (frei) ; VOC (frei) ; octadecanoid pathway (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Pflanzen können Duftstoffe aus ihren Blüten, Blättern und Früchten emittieren, die den Pflanzen als Lockstoffe, Abwehrstoffe oder Signalsubstanzen dienen können. Viele Pflanzen emittieren konstitutiv eine Reihe verschiedener Mono- und Sesquiterpene. Drüber hinaus gibt es aber auch induzierbare Emissionen. Die Einwirkung von Stressoren wie z. B. Fraßfeinden, Bakterien, Pilzen oder Ozon führt in Pflanzen zur Neusynthese und Emission von Abwehrstoffen und Signalmolekülen. Diese werden hauptsächlich über den Octadecanoid und Shikimatweg gebildet. Im Octadecanoidweg werden Alkohole und Aldehyde (überwiegend C6-Verbindungen) ausgehend von freien Fettsäuren über eine Enzymkaskade (Lipase, Lipoxygenase, Hydroperoxidlyase) gebildet und emittiert. Der Shikimatweg ist wichtig für die Bildung des wichtigen Pflanzenhormons Salicylsäure (SA). Nach anschließender Methylierung kann SA als das flüchtige Salicylsäuremethylester (MeSA) in die Atmosphäre emittiert werden. Ziel dieser Arbeit war, bei der Modellpflanze Tomate (cv. Moneymaker) zu prüfen, inwiefern stressinduzierte Emissionen Rückschlüsse auf bestimmte stressinduzierte pflanzeninterne Enzymaktivitäten oder Substratkonzentrationen zulassen. Das würde eine nicht invasive Messung solcher pflanzeninterner Größen erlauben. Zum einen sollte geprüft werden, ob sich die Emissionen von Blattalkoholen und -aldehyden (GLA: green leaf alcohols/aldehydes) eignen, Aussagen über die Enzymaktivitäten der Lipase, Lipoxygenase und Hydroperoxidlyase oder über Substratkonzentrationen im Octadecanoidweges zu treffen. Die Messung der GLAs erfolgte online mittels GC/MS, die Zwischen-produkte (freie Fettsäuren, Hydroperoxyfettsäuren) wurden mittels HPLC gemessen und die Enzymaktivitäten mittels UV/VIS-Spektrometrie. Eine gute Korrelation zwischen den Emissionen und einer bestimmten Enzymaktivität bzw. Substrat-konzentration wäre dabei einen Hinweis auf den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in dieser Kaskade. Zum anderen sollte geprüft werden, ob sich die Emissionen von MeSA eignen, auf die endogenen Konzentrationen von SA rückzuschließen. Auch hier wurde versucht, die Emission von MeSA mit der endogenen SA-Konzentration zu korrelieren. Die Messung der MeSA-Emission erfolgte dabei ebenfalls online mittels GC/MS, die der endogenen Salicylsäure- konzentrationen mittels HPLC. Ozonexposition und Pilzinfektion (Botrytis cinerea) wurden als abiotischen bzw. biotischen Stressoren angewendet. Die Stressantwort der Tomatenpflanzen auf die Ozonexposition erfolgte mit einer Zeitverzögerung zwischen 1 und 3 Stunden nach Beendigung der Ozonzugabe. Die Pflanzen reagierten mit der Emission von Methanol, GLAs und MeSA sowie mit der Erhöhung der Emissionen von Mono- und Sesquiterpenen. Pflanzen wurden aus der Kammer entnommen, unter Flüssigstickstoff in einem Möser schockgefroren, homogenisiert und bis zur Extraktion und Messung der Enzymaktivitäten und der Salicylsäurekonzentrationen bei -80°C gelagert. Während die GLA-Emissionen keine guten Korrelation zu den Lipase- und Hydroperoxid-lyaseaktivitäten aufwiesen (0,19 bzw. 0,41), wurde eine gute Korrelation zwischen der Lipoxygenaseaktivität und den stressinduzierten Emissionen gefunden (0,82). Das deutet auf die Lipoxygenaseaktivität als geschwindigkeitsbestimmenden Schritt bei der GLA-Emission hin. Freie Fettsäuren waren sowohl in Kontroll- als auch in gestressten Pflanzen in ähnlicher Größenordnung vorhanden. Eine Substratlimitierung durch geringe Verfügbarkeit freier Fettsäuren als geschwindigkeitsbestimmender Schritt scheint damit unwahrscheinlich. Die Konzentration an Hydroperoxyfettsäuren lag immer unterhalb der Bestimmungsgrenze, womit auch eine Substratlimitierung der Hydroperoxidlyase auch als „bottle neck“ bei der GLA Emission angesehen werden kann. Auch eine solche Substrat- limitierung sollte sich in der gefundenen guten Korrelation zwischen GLA Emissionen und Lipoxygenaseaktivität bemerkbar machen. Aufgrund dieser guten Korrelation ist es bei Botrytisbefall und Ozonflussdichten zwischen 3*10-8 – 8*10-8 mol m-2 s-1 möglich, von der Emissionsstärke der GLAs direkte Rückschlüsse auf die Lipoxygenaseaktivität machen. Dennoch sind die GLA-Emissionen nicht uneingeschränkt zur Bestimmung der Lipoxygenaseaktivität geeignet. Insbesondere bei hohen Ozonflussdichten zeigen sich durch eine starke Erhöhung der Emissionen starke Abweichungen vom linearen Zusammenhang zwischen der Emissionsstärke und der Lipoxygenase-Aktivität. Auch zwischen den MeSA-Emissionen und den Gehalten an freier Salicylsäure in den Pflanzen wurde ein recht guter Zusammenhang gefunden, die es erlauben sollte von den MeSA Emissionen auf SA Konzentrationen zu schließen. Insgesamt zeigte sich, dass Rückschlüsse über bestimmte pflanzeninterne Enzymaktivitäten und Stoffmengen über flüchtige Emissionen möglich sind. Diese Emissionen erlauben daher eine nicht invasive Bestimmung dieser Größen mit recht guter Zeitauflösung.

Plants are able to emit flavours over their flowers, leaves and fruits. These flavours serve them as attractants, repellents or signal molecules. Many plants show a constitutive emission of a series of different mono- and sesquiterpenes. Futhermore plants have also inducible emissions. The influence of stressors like e.g. predators, bacteria, fungi or ozone yield to novel synthesis and emission of repellents and signal molecules. They originate mainly form octadecanoid and sikimate pathway. The octadecanoid pathway yields in the formation of alcohols and aldehyds (predominatly C6-compounds). Starting form free fatty acids they were generated and emitted via an enzyme cascade (lipase, lipoxygenase, hydroperoxidelyase). The Shikimat pathway is important for the formation of the important plant hormone salicylic acid (SA). After methylation SA can be emitted as the volatile methylsalicylate MeSA) into the atmosphere. The main task of the work was to approve if it is possible to draw conclusions from stress induced emissions to certain plant internal enzyme activities or substrate concentration in the model plant tomato (cv. Moneymaker). The would allow a non invasive measurement of such endogenous parameters. On the one hand it should be proved if the emission of green leave aldehyds and alcohols (GLAs) can be suitable for the prediction of the enzyme activities lipase, lipoxygenase and hydroperoxidelyase or the substrate concentrations in the octadecanoid pathway. The GLAs were measured by online GC/MS, the intermediates (free fatty acids, hydroperoxy fatty acids)by HPLC and the enzyme activities by UV/VIS spectroscopy. A good correlation between a certain enzyme activity/substrate concentration should then be a hint to the rate-determining step in the cascade. On the other hand it should be proved if emission of MeSA can be suitable for the prediction of endogenous free SA concentration. Also in this case I looked for a correlation between the MeSA emission and the plant internal SA concentration. The measurement of MeSA were measured by online GC/MS as well and the endogenous SA concentrations by HPLC. Ozone exposure and infection by fungi (Botrytis cinerea) were used as abiotic/biotic stressors respectively. The stress response on ozone exposure of the tomato plants started with varying lag times between 1 and 3 hours. The plants reacted with the emission of methanol, GLAs and MeSA as well as increasing of the emissions of mono- and sesquiterpenes. The plants were removed from the chamber, snap frozen and homogenised with pistil and mortar and stored at -80°C until the extraction and measurement of the enzyme activities/SA concentrations respectively. Whereas the GLA emissions showed no good correlations with lipase and hydroperoxidelyase activities (0.19 and 0.41) the correlation with the lipoxygenase activity was quite good (0.82). This points to the lipoxygenase to be the rate-determining step for the GLA emission. Free fatty acids were found in similar concentrations both in control plants and stressed plants. Substrate limitation by low availability of free fatty acids hence seems not to be ratedetermining. The concentration of hydroperoxy fatty acids were always beyond the detection limit, therefore the lack of substrate for the hydroperoxidelyase may be the "bottle neck" for the GLA emission strength. Also this substrate limitation should lead to a good correlation between GLA emission and lipoxygenase activity. Due to this good correlation it is in cases of Botrytis infection and ozone fluxes between 3•10-8 and 8•10-8 mol m-2 s-1 possible to predict internal enzyme activities by measurement of the GLA emissions. However the GLA emission are not in all cases sufficient to predict the lipoxygenase activity without restrictions. In particular high ozone fluxes into the plant yielded in very high GLA emissions and strong variances form the linear correlation between emission and lipoxygenase activity occurred. Also the emission of MeSA and the internal concentration of free SA showed a good correlation (0.91). Though it should possible to estimate the endogenous free SA concentration by measuring the MeSA emission. All in all this work shows that it is possible to conclude different plant internal enzyme activities and amounts of substances using the measurement of volatile compounds. Though these emissions allow the not invasive determination of these parameters in a good demand interval.

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