Entwicklung einer modellbasierten Hochdurchsatztechnik zur Enzymcharakterisierung mit Schwerpunkt auf Langzeitstabilität

Rachinskiy, Kirill; Büchs, Jochen

doi:2884

Entwicklung einer modellbasierten Hochdurchsatztechnik zur Enzymcharakterisierung mit Schwerpunkt auf Langzeitstabilität = Development of a model based high throughput enzyme characterization technique with a focus on the long term stability

Rachinskiy, Kirill (Author)

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Kirill Rachinskiy

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

UmfangGetr. Zählung : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Zsfassung in engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-10-14

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-28843
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/51232/files/Rachinskiy_Kirill.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Ingenieurwissenschaften (frei) ; Mikrotiterplatte (frei) ; Enzymstabiltät (frei) ; microtiter plate (frei) ; enzyme stability (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine neuartige Apparatur „Enzymprüfstand“ entwickelt, welche die modellbasierte Charakterisierung von enzymatisch katalysierten Reaktionssystemen mit hohem Durchsatz ermöglicht. Somit lassen sich erstmals neben der bisher etablierten Enzymanfangsaktivität auch komplexere Prozesseigenschaften wie die Langzeitstabilität als Kriterium für die Enzymwahl in das Screening mit einbeziehen. Die Technik basiert auf der mathematischen Modellierung des Enzymverhaltens. Unterschiedliche Vorgänge, wie der Wechsel zwischen Faltungszuständen, die Enzymaktivierung und -deaktivierung werden als temperaturabhängige Reaktionen abgebildet. Dabei wird die unterschiedliche Geschwindigkeit der einzelnen Vorgänge berücksichtigt. So ist z.B. der Wechsel zwischen den Faltungszuständen so schnell, dass er im Rahmen des Messintervalls als temperaturabhängiges Gleichgewicht angesehen und als algebraische Gleichung modelliert wird. Die irreversiblen Deaktivierungseffekte können hingegen so langsam sein, dass sie erst auf der Zeitskala von Wochen oder Monaten sichtbar werden. Solche Effekte gilt es durch gezielte Temperaturführung in kurzen Experimenten zu beschleunigen und zu erfassen. Die modellbasierte Enzymcharakterisierung sieht die Temperatur als wichtigste Steuergröße in den Experimenten vor. Über die Systemantwort auf unterschiedliche Temperaturprofile wird das Modell des Enzymverhaltens identifiziert. Als Systemantwort dienen optische Signale, welche im direkten Zusammenhang mit der Produktbildung der enzymkatalysierten Reaktion stehen. In einem iterativen Vorgang werden Temperaturprofile entworfen, Experimente durchgeführt und Modellparameter geschätzt. Wird ein Modell identifiziert, welches in der Lage ist, das experimentelle Verhalten durch signifikante Parameter zu beschreiben und vorauszusagen, gilt das Stoffsystem als charakterisiert. Im Rahmen der Modellgültigkeit werden die Zielgrößen der Prozessentwicklung, wie z.B. die zeit- und temperaturabhängige Raum-Zeit-Ausbeute simuliert und optimiert. Somit besteht erstmals eine Methode, welche solche prozessrelevanten Größen als Screeningkriterien berücksichtigt. Apparativ ist der Enzymprüfstand in der Lage auf der Plattform einer 96-Well-Mikrotiterplatte die Steuergröße Temperatur zwischen 5 und 85°C mit einer Geschwindigkeit von +/-1°C/min mit einer Homogenität von +/-0,5°C zu regeln. Durch den Schüttelvorgang wird eine definierte Durchmischung erreicht. Bei sauerstoffverbrauchenden Reaktionen besteht die Möglichkeit einer definierten Begasung. Die Reaktionsüberwachung erfolgt online, nicht invasiv und ohne Unterbrechung des Schüttel- und des Temperiervorganges. Die fluoreszenzbasierte Messtech-nik ermöglicht eine flexible Verstellung der Anregungs- und Emissionswellenlängen im Bereich zwischen 200 und 750 nm während der Messung, sodass Intensitätswerte bei unterschiedlichen Wellenlängen oder auch Fluoreszenzspektren aufgenommen werden können. Die Versuchsführung erfolgt automatisiert. Die Charakterisierung des temperaturabhängigen Sauerstoffeintrages ist noch zu präzisieren. Im Rahmen der Arbeit wurden zwei Assays etabliert, welche bei sich ändernden Temperaturen für die Reaktionsdauer von bis zu ca. 10 h funktionieren. Ein Assay ist für jede pH-aktive Reaktion anwendbar. Er wurde am Beispiel einer Esterhydrolysereaktion etabliert. Der zweite Assay eignet sich für die Überwachung einer jeden sauerstoffverbrauchenden Reaktion. Er wurde an einem Laccase-Mediator-System und an einer Glucose-Oxidationsreaktion etabliert. Eine weitere vielversprechende optische Methode, die unterstützende Messung der Trp-Eigenfluoreszenz von Enzymen, wurde erfolgreich getestet und mit den Messungen der Reaktionsgeschwindigkeit korreliert. Ansätze für die Entwicklung weiterer universeller Assays wurden diskutiert. Das pH-aktive System und das sauerstoffverbrauchende System wurden beispielhaft am Enzymprüfstand charakterisiert. Die zeitliche und räumliche Extrapolierbarkeit der Modellvoraussage wurde für beide Systeme anhand von Langzeitmessungen gezeigt.

A new high throughput technique for enzyme characterization with specific attention to the long term stability, called "Enzyme Test Bench", is presented. The concept of the Enzyme Test Bench consists of short term enzyme tests in 96-well microtiter plates under partly extreme conditions to predict the enzyme long term stability under moderate conditions. The technique is based on the mathematical modeling of temperature dependent enzyme activation and deactivation. Adapting the temperature profiles in sequential experiments by optimal non-linear experimental design, the long term deactivation effects can be purposefully accelerated and detected within hours. During the experiment the enzyme activity is measured online to estimate the model parameters from the obtained data. Thus, the enzyme activity and long term stability can be calculated as a function of temperature. The engineered instrumentation provides for simultaneous automated assaying by fluorescent measurements, mixing and aeration as well as homogenous temperature control in the range of 10-85°C. Fluorescent assays for online acquisition of different reactions, e.g. hydrolysis reactions by pH-shift and oxidation reactions by DOT, are developed and established. The developed instrumentation and assay are applied to characterize two esterases and a complex, multi-stage laccase-mediator system. The results of the enzyme characterization of both esterases, carried out in microtiter plates applying short term experiments of hours, are in good agreement with the results of long term ex-periments at different temperatures in 1L stirred tank reactors of a week. Thus, the new technique allows for both: the enzyme screening with regard to the long term stability and the choice of the optimal process temperature regarding such process parameters as turn over number, space time yield or optimal process duration. The comparison of the temperature dependent behavior of both characterized enzymes clearly demonstrates that the frequently applied estimation of long term stability at moderate temperatures by simple activity measurements after exposing the enzymes to elevated temperatures may lead to suboptimal enzyme selection. Thus, temperature dependent enzyme characterization is essential in primary screening to predict its long term behavior.

Fulltext:
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