Physiological, genetic and molecular analysis of two Arabidopsis mutants with defects in normal development

Pooraiiouby, Rana; Slusarenko, Alan

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-26025

Physiological, genetic and molecular analysis of two Arabidopsis mutants with defects in normal development = Physiologische, genetische und molekulare Analyse von zwei Arabidopsis-Mutanten mit Wachstumsdefekt

Pooraiiouby, Rana (Author)

2008

VerantwortlichkeitsangabeRana Pooraiiouby

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

UmfangVIII, 154 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Slusarenko, Alan (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-10-31

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-26025
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50176/files/Pooraiiouby_Rana.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Pflanzenphysiologie (Genormte SW) ; Pflanzen (Botanik) (frei) ; molekulare Analyse (frei) ; molecular (frei) ; genetic (frei) ; physiological (frei) ; characterization (frei) ; arabidopsis (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 580

Kurzfassung
Im Gegensatz zu tierischen Zellen, haben Pflanzenzellen eine feste Zellwand und können sich deswegen nicht bewegen. So sind sie nach der Zellteilung fest eingebettet in ihrer relativen Position zu den Nachbarnzellen. Daher ist die Orientierung der Zellteilungsebene kritisch für eine normale Pflanzenorganmorphogenese. Kortikale Mikrotubuli (MT) spielen eine wichtige Rolle in diesem Vorgang indem sie die Präprophasebande (PPB). Nach der Mitose bildet sich eine neue Zellwand während der Zellteilung in der Ebene zwischen den zwei Tochterzellen. Der Phragmoplast, eine weitere Struktur, die MT beinhaltet, bildet eine Ebene zwischen den zwei Tochterzellkernen aus und an ihm wird die neue Zellwand abgelagert. MT kommt bei der Festlegung des Pflanzenwuchshabitus eine weitere Rolle zu, da MT wichtig für die parallele Ausrichtung von Zellulosemikrofibrillen in der Zellwand sind. So bestimmen die MT-Muster das Muster der Zellulosemikrofibrillen auf der Außenseite der Plasmamembran. Die Ausrichtung der Zellulosemikrofibrillen hat wiederum Auswirkungen auf die Flexibilität der Zellwand und kontrolliert die Richtung des Zellexpansionswachstums. Pflanzenzellen werden durch pektische Polysaccharide, die Polygalakturonsäure enthalten, miteinander verbunden und Pektin ist ein Bestandteil der Matrix, die die Zellulosemikrofibrillen umgibt. Somit kommt MT und pektischen Polysacchariden eine aktive und wichtige Rolle bei der Ausprägung der Zell- und Organmorphologie zu. Während der Selektion von transgenen Arabidopsis Linien fielen zwei Mutanten auf, die interessante Phänotypen aufwiesen und wurden ausgewählt für weitere Untersuchungen. In der einen Mutante war ein Gen defekt, das für ein Enzym kodiert, das im Metabolismus von pektischen Polysacchariden beteiligt ist („pgase”). Die andere Mutante („bushy-ff”) hatte T-DNA Insertionen in zwei Genen: eine in einem Gen, das bekanntermaßen Auswirkungen auf die MT Organisation hat und die andere in einem Gen mit unbekannter Funktion. In meiner Doktorarbeit charakterisierte ich diese beiden Mutanten. Im Spezifischen ging ich die folgenden Fragen an: Was sind die morphologischen und anatomischen Defekte in der „pgase” Mutante? Mit Licht- und Rasterelektronenmikroskopie konnte ich zeigen, dass die Pflanze im Durchmesser und der Höhe reduziert war und dass die Blätter etwas uneben waren. Bei den Geweben waren die auffallendsten Defekte, dass die Zahl der Trichome um ca. 30% verringert war und auch die Anzahl der Schließzellen der Spaltöffnungen im Vergleich zu dem Wildtyp verringert war. Was war die molekulare Ursache dieser Mutante? Thermal asymmetric interlaced (=TAIL) PCR zeigte eine T-DNA Insertion in einem Mitglied der Familie der Polygalakturonasen von Arabidopsis, At3g07970. Semi-quantitative RT-PCR zeigte eine ungefähr um Faktor 3 verringerte Expression von At3g07970 in der „pgase” Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Komplementation der Phänotypen der „pgase” Mutante durch Überexpresssion des „PGase” Gens und Untersuchungen an einer weiteren T-DNA Insertionsmutante im At3g07970 Gen, die morphologische Phänotypen aufwies, die sich nicht von denen der ursprünglichen „pgase“ Mutante unterschieden, zeigten, dass diese Mutation verantwortlich für die beobachteten Phänotypen war. Zellwände sind wichtige Barrieren für biotische und abiotische Stressoren. Da die Mutation in einem „PGase” Gen wahrscheinlich zu Veränderungen in der Zellwand führt untersuchte ich die Antwort der “pgase” Mutante auf biotischen und abiotischen Stress. Dafür wurde die Mutante einer Infektion mit Hyaloperonospora arabidopsidis, Kälte, Hitze und Trockenstress ausgesetzt. Wir fanden dass diese Mutante erhöht anfällig gegenüber der Infektion mit H. arabidopsidis, Kälte und Hitze Stress war. Folgende Fragen wurden an der „bushy-ff” Mutante untersucht: Was sind die morphologishen und anatomischen Defekte in der „bushy-ff” Mutante? Mit dem Licht- und Rasterelektronenmikroskop fanden wir, dass alle Organe einschließlich der Wurzeln, Blätter und Blüten abnormal in dieser Mutante waren. Die „bushy-ff” Pflanzen waren in allen Dimensionen stark komprimiert. Auf der Gewebe- und Zellebene wurden verschiedene Defekte beobachtet, z. B. waren die Wurzelzellen der „bushy-ff” Pflanzen um ~30% kleiner als die von Col-0 Wurzelzellen, die Zahl der Trichome war ungefähr halbiert, die Verzweigung der Trichome war verändert und die Differenzierung des Mesophylls in Schwamm- und Palisadenmesenchym war fehlerhaft. Was war die molekulare Ursache dieser Mutante? Thermal asymmetric interlaced (=TAIL) PCR zeigte zwei unabhängige T-DNA Insertionen, eine im Promoter eines bis dato uncharakterisierten F-box Gens (At1g77000) und eine weitere im Promoter des bereits als kortikale MT organisierenden bekannten FASS Gens (At5g18580). Molekulare Analysen wiesen auf eine im Vergleich zum Wildtyp um 50% reduzierte Expression der FASS and F-box Gene hin. In Linien, in denen entweder F-box oder FASS konstitutiv im „bushy-ff” Mutanten Hintergrund exprimiert wurden, wurde beobachtet, dass in beiden Fällen die beobachteten „bushy-ff” Phänotypen komplementiert wurden. Dies legt nahe, dass die Mutationen in beiden Genen gleichzeitig vorhanden sein muss, um die „bushy-ff” Mutanten Phänotypen hervorzurufen. Genetische Experimente, die Kreuzungen von „bushy-ff” mit Wildtyp sowie Kreuzungen zwischen Einzelgen-Mutanten in f-box und fass Mutanten beinhalteten, bestätigten, dass beide Mutationen auftreten mussten und ausreichend waren für den „bushy-ff” Phänotyp. Das Gewebe-spezifische Expressionsmuster von F-box and FASS zeigte, dass beide Gene auf ungefähr gleichem Niveau in allen getesteten Geweben exprimiert wurden beruht die genetische Interaktion zwischen dem F-box und dem FASS Gen auf einer physikalischen Interaktion? Mittels dem Hefe-Zwei-Hybrid Systems konnten wir zeigen, dass F-box und FASS Proteine miteinander interagierten. Wo in der Pflanzenzelle findet sich das F-box Protein? Transgene Linien, die konstitutiv eine Fusion aus F-box und Grün-Fluoreszierendem Protein (GFP) im „bushy-ff” Mutanten Hintergrund exprimierten (35S::F-box-GFP), zeigten eine intrazelluläre Verteilung von F-box Protein, die sehr ähnlich zu der Verteilung eines MT-assoziierten Proteins war (GFP-TUA6). Zusammengefasst legen unsere Daten nahe, dass FASS kortikale MT organisieren könnte mittels der Interaktion mit dem F-box Protein.

Unlike animal cells, plant cells have a rigid wall and hence cannot migrate. Rather, they are permanently fixed in their relative position to neighbouring cells after cell division. Therefore, for normal plant organ morphogenesis the orientation of the cell division plane is critical. Cortical microtubules (MTs) play an important role in this process by forming a structure called the preprophase band (PPB). After mitosis, a new cell wall is formed during cytokinesis in the plane between the two daughter cells. The phragmoplast, another structure containing MTs, forms in the plane between the two daughter nuclei and lays down the new cell wall. A further role for MTs in determining plant stature stems from the fact that MTs are important for the parallel deposition of cellulose fibres in the cell wall. Thus, the patterns formed by the MTs direct the patterning of cellulose microfibrils on the outer side of the plasma membrane. Cellulose microfibril orientation has consequences on cell wall flexibility and controls the direction of cell expansion-growth. Plant cells are cemented together by pectic polysaccharides containing polygalacturonic acid, and pectin is a component of the matrix surrounding the cellulose microfibrils. Thus, MTs and pectic polysaccharides play an active and important role in establishing cell and organ morphology. In the process of selecting Arabidopsis transgenic lines two mutants were noticed with interesting phenotypes and these were selected for further study. In one mutant a gene coding for an enzyme involved in pectic polysaccharide metabolism was affected (“pgase”) and the other mutant (“bushy-ff”) had T-DNA insertions in two genes: one in a gene known to affect MT organization and the other in a gene of unknown function. During my thesis I characterized those mutants. Specifically I addressed the following aspects: What are the morphological and anatomical defects in the “pgase” mutant? Using light and scanning electron microscopy, it was shown that the total size of the plant in diameter and height was reduced and the leaves were somewhat twisted. At the tissue level the most obvious defects were the ~30% decreased number of the trichomes and reduced number of the epidermal guard cells in comparison to wild-type plants. What was the molecular basis of this mutant? Thermal asymmetric interlaced (=TAIL) PCR showed a T-DNA insertion in the Arabidopsis polygalacturonase (PGase) family member, At3g07970. Semi-quantitative RT-PCR showed a ~3Xfold lower expression of At3g07970 in the “pgase” mutant compared to the wild-type. Complementation of the “pgase” mutant phenotypes by over expression of the PGase At3g07970 gene, and analysis of an independent T-DNA insertion in At3g07970 that displayed an indistinguishable morphological phenotype to the original mutant, showed that this mutation was responsible for the observed phenotypes. Cell walls are important barriers for biotic and abiotic stresses. Since a mutation in a PGase At3g07970 gene likely results in altered cell walls, the responses of the “pgase” mutant to biotic and abiotic stresses were studied. To this end, this mutant was exposed to infection with Hyaloperonospora arabidopsidis, cold, heat and drought stress. We found that this mutant was hypersusceptible to infection with H. arabidopsidis, cold and heat stress.For the “bushy-ff” mutant the following aspects were addressed: What are the morphological and anatomical defects in the “bushy-ff” mutant? Using light and scanning electron microscopy, we found all of the organs including roots, leaves and flowers were abnormal in this mutant. The “bushy-ff” plants were strongly compressed in all dimensions. At the tissue and cellular level, several defects were observed, e.g. the size of the root cells of “bushy-ff” was ~30% smaller than Col-0 root cells, the total number of the trichomes was half of that in wild-type plants, branching of the trichomes was altered and differentiation of mesophyll cells into palisade and spongy cells in the“bushy-ff” mutant was aberrant. What was the molecular basis of this mutant? Thermal asymmetric interlaced (=TAIL) PCR showed that two independent T-DNA insertions, one in the promoter of a so far uncharacterized F-box At1g77000 gene and another in the promoter of the previously characterized, cortical microtubule organizing FASS At5g18580 gene occurred in this mutant. Further molecular analysis indicated about 50% lowered expression of the FASS and F-box At1g77000 gene as compared to wild-type. By generating lines constitutively expressing either F-box At1g77000 or FASS in the “bushy-ff” mutant background, it was observed that the “bushy-ff” phenotype could be complemented in both cases. This suggested that concomitant mutations in both genes were required for the “bushy-ff” mutant phenotype. Genetic experiments involving crosses between “bushy-ff” and wild-type as well as crossing single f-box At1g77000 to single fass mutants further confirmed that both mutations occurring in the “bushy-ff” mutant were both necessary and responsible for the “bushy-ff” phenotype. The expression pattern and organ specificity analysis of the F-box At1g77000 and FASS showed that both genes were expressed at similar levels relative to each other in all organs tested. Does the genetic interaction between the F-box At1g77000 and FASS genes reflect a physical interaction? Using yeast two hybrid analysis we could in fact show that the F-box At1g77000 and FASS proteins can also interact physically with each other. Where is the F-box At1g77000 protein localized inside the plant cell? Transgenic lines constitutively expressing a fusion protein of F-box At1g77000 with green fluorescent protein (35S::F-box At1g77000-GFP) in the “bushy-ff” mutant background were generated and showed an intracellular distribution of F-box At1g77000 that was similar to that of a microtubule associated protein (GFP-TUA6). In summary our data suggest that FASS might organize cortical microtubules through its interaction with an F-box At1g77000 protein.

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