PEG-gebundene Oligosaccharide als biomolekulare Erkennungsstrukturen auf Grenzflächen

Sauerzapfe, Birgit; Elling, Lothar

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-23753

PEG-gebundene Oligosaccharide als biomolekulare Erkennungsstrukturen auf Grenzflächen = PEG-bound oligosaccharides as biomolecular recognition structures on surfaces

Sauerzapfe, Birgit (Author)

2008

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Birgit Sauerzapfe

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2008

Umfang246 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2008-02-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-23753
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/50025/files/Sauerzapfe_Birgit.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Glykobiochemie (Genormte SW) ; Nanotechnologie (Genormte SW) ; Funktionalisierung <Chemie> (Genormte SW) ; Polyethylenglykole (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; LacNAc (frei) ; Poly-LacNAc (frei) ; Biomaterialien (frei) ; glycobiotechnology (frei) ; surfaces (frei) ; PEG (frei) ; biomaterials (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das vorliegende Dissertationsvorhaben „PEG-gebundene Oligosaccharide als biomolekulare Erkennungsstrukturen auf Grenzflächen“ hatte das Ziel, erstmals Glykane und deren spezifische Wechselwirkungen mit weiteren Proteinen der extrazellulären Matrix für die Biofunktionalisierung von Oberflächen zu nutzen. In der Natur umgeben Zuckerstrukturen die Oberflächen der tierischen Zellen und agieren somit als Antennen und Informationsträger. Ein bedeutendes Glykokonjugat ist Poly-N-Acetyllaktosamin (Poly-LacNAc), ein Polysaccharid bestehend aus repetierenden Galaktose- und N-Acetylglukosamin (GlcNAc)-Untereinheiten. Diese Zuckerketten sind für die inter- und intrazelluläre Kommunikation verantwortlich. Des Weiteren wird Poly-LacNAc durch Galektine gebunden und ist damit in die galektin-abhängige Bindung von extrazellulären Glykoproteinen, wie z. B. Laminin und Fibronektin, involviert. Daher sollten Poly-LacNAc-Strukturen chemo-enzymatisch synthetisiert, auf Oberflächen immobilisiert und für die Bindung von extrazellulären Matrixproteinen für eine gerichtete Zelladhäsion charakterisiert werden. Das Ziel konnte erfolgreich realisiert werden. Innerhalb dieser Arbeit war es möglich eine artifizielle extrazelluläre Matrix ausgehend von immobilisierten Poly-LacNAc-Strukturen auf PEG-Sternhydrogelen effizient aufzubauen. Zunächst mussten dafür chemisch modifizierte Zucker produziert werden, die sowohl eine selektive Immobilisierung als auch eine effektive enzymatische Poly-LacNAc-Synthese ermöglichten. Das beta-D-GlcNAc-Linker-NH2-tBoc stellte sich dabei als ideales Substrat für die biokatalytischen Umsätze heraus. Das Akzeptorglykosid war aufgrund seines Linkers durch die HPLC quantifizierbar und durch C18-Säulen effizient aufzureinigen. Die rekombinante His6-Propeptid-cat-beta-4GalT-1 konnte das hydrophobe GlcNAc optimal umsetzen und zeigte damit den positiven Einfluss eines Fusionsproteins auf die biokatalytischen Eigenschaften der humanen beta-4GalT-1. Die effiziente Poly-LacNAc-Synthese konnte in Kombination mit der beta-3GlcNAcT von Helicobacter pylori durchgeführt werden. Dabei wurden nicht nur spezifische Oligosaccharide, sondern auch eine heterogene, aber definierte Mischung von Poly-LacNAc-Strukturen produziert. Die enzymatischen Syntheseprozesse wurden detailliert kinetisch untersucht. In einem weiteren Schritt konnte die erfolgreiche Produktion von modifizierten Poly-LacNAc-Strukturen, wie Galili-Epitope, Sialyl- und sulfatierte LacNAc-Strukturen, etabliert werden. Für die Analyse und Bindung der produzierten Poly-LacNAc-Strukturen wurde neben den kommerziellen pflanzlichen Lektinen auch das fungale Galektin CGL2 als Modellgalektin verwendet. Dieses wurde für eine effiziente Aufreinigung und für eine spezifische Detektion mit einem N-terminalen His6-Tag versehen und rekombinant in E. coli produziert. Innerhalb der neu etablierten Mikrotiterplatten-Testsysteme konnte nicht nur die optimale Zuckerbindungsstruktur des Galektins His6CGL2 bestimmt werden, sondern auch die weitere Bindung der ECM-Proteine Laminin und Fibronektin an eine optimierte Schicht nachgewiesen werden. Dabei stellte sich die definierte heterogene Poly-LacNAc-Mischung mit einer Zusammensetzung aus überwiegend Di- bis Tetra-LacNAc-Strukturen als optimaler Ligand heraus, der bisher für Untersuchungen in der glykobiologischen Forschung vernachlässigt wurde. Diese Ergebnisse konnten auf die Funktionalisierung von PEG-Sternhydrogelen übertragen werden. Das Mikrokontaktstempeln mit komplexen Zuckerstrukturen konnte etabliert und optimiert werden. Ausgehend von immobilisierten Poly-LacNAc-Strukturen wurde eine artifizielle Matrix mit Kollagen IV aufgebaut. Dabei konnte dieser Aufbau sowohl mit quervernetzendem multivalenten Galektin His6CGL2 als auch ohne etabliert werden. Die ersten Zellversuche mit der Mausfibroblasten Zelllinie L929 und humanen Fibroblasten zeigten das enorme Anwendungspotential dieser Oberflächen für die Biomaterialforschung. Die Zellen konnten sehr gut auf den biomimetischen Schichten adhärieren und proliferieren. Zusammenfassend bleibt zu betonen, dass in dieser Arbeit zum ersten Mal die native Bindung von komplexen glykosylierten extrazellulären Matrixproteinen über die Multivalenz der Galektine an eine mikrostrukturierte Poly-LacNAc-PEG-Sternschicht gezeigt werden konnte. Dabei ist vor allem die etablierte effiziente chemische Synthese des modifizierten Akzeptorsubstrats GlcNAc als auch die einfach durchzuführende und effektive Synthese einer heterogenen, aber definierten Poly-LacNAc-Mischung durch den kombinierten Einsatz der beta-4GalT und beta-3GlcNAcT hervorzuheben. Diese Mischung scheint am ehesten die natürliche Situation zu imitieren und die Galektinbindung hoch-affin zu vermitteln. Zukünftige Arbeiten mit komplex verzweigten Zuckerstrukturen, mit humanen Galektinen und mit weiteren Zelltypen können weitere neuartige Impulse für die Biomaterialforschung hervorbringen.

The targeting of cells to biomaterial surfaces can be achieved by functionalization of the interface with specified biomolecular recognition structures. The aim is the production of biohybrid systems with nano- and micro-structured surfaces to control the molecular mechanism of the cell. The cell surface is very “sweet” and is surrounded by a thick layer of sugars. These sugar chains are arranged like antennas which act as recognition structures and information carriers. One important glycan structure is poly-N-acetyllactosamine (poly-LacNAc) that fulfils the major function during inter- and intracellular communication events. This sugar structure has been identified as important ligand for galectin-mediated cell adhesion to extra-cellular matrix glycoproteins (laminin, fibronectin). Therefore poly-LacNAc shall be synthesized by chemo-enzymatic methods, coupled to specialized surfaces and characterized for its usage in the biomaterial research. The first step of the synthesis strategy comprised the chemical synthesis of beta-glycosides of GlcNAc to facilitate a controlled coupling onto chemically functionalized surfaces (cooperation with Prof. Dr. Kren, ASCR, Czech Republic). The best result could be reached with the product beta-D-GlcNAc-linker-NH2-tBoc which can be easily attached to amino-reactive surfaces. In a further step the glycoside was converted as acceptor substrate by human and bacterial beta-1,4-galactosyltransferases for the production of LacNAc in a biocatalytical one-pot-reaction (cooperation with Dr. W. W. Wakarchuk, NRC, Canada). The fusion protein His6-propeptide-beta-4GalT-1 turned out to be the most productive enzyme. It showed a preference for hydrophobic substrates by quantitative conversion of 5 mM acceptor substrate in 3 h. The enzymatic synthesis of poly-LacNAc structures was accomplished by the combination of His6-propeptide-beta-4GalT-1 with beta-3GlcNAcT from Helicobacter pylori. Kinetic data and conditions for an optimal conversion of the hydrophobic substrates were determined. Even more, the produced defined poly-LacNAc structures were used as acceptor substrates for further enzymatic modifications corresponding to nature or for a specific enzymatic labelling with UDP-Gal-biotin. The functionalised LacNAc and poly-LacNAc structures could be easily purified by solid phase extraction. A deprotection step yielded the amino-terminating sugar structures which were subsequently coupled to functionalised microtiter plates. The functionalisation of amino reactive microtiter plates was a suitable small scale test system. The detection of the immobilized structures could be done with commercially available lectins or with the recombinantly expressed fungal galectin His6CGL2. Even more, an enzymatic procedure could be established to label sugar structures in a specific and more sensitive way. Finally, the binding of extracellular glycoproteins (laminin, fibronectin) to the functionalized microtiter plates could be shown. After establishing the chemical and enzymatic synthesis of the poly-LacNAc structures, their immobilization onto surfaces and their detection work should be started with biomaterial surfaces. Therefore functionalization experiments were done with PEG-star surfaces in a close cooperation with Prof. Dr. Möller (DWI, RWTH Aachen). It could be shown that it was not only possible to immobilize the glycans onto the surface but also to be build up an artificial extracellular matrix via the galectin His6CGL2 with collagen IV, fibronectin and laminin. Finally, these biofunctionalized surfaces could be used for targeted cell adhesion by poly-LacNAc- and galectin-mediated binding of collagen IV.

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