A new method to quantify the CO 2 sensitivity of micro-organisms in shaken bioreactors and scale up to stirred tank fermentors

Amoabediny, Ghassem; Büchs, Jochen

doi:1659

A new method to quantify the CO 2 sensitivity of micro-organisms in shaken bioreactors and scale up to stirred tank fermentors = Eine neue Methode zur Quantifizierung der CO2 Empfindlichkeit von Mikro-Organismen in geschüttelten Bioreaktoren und deren Scale-Up auf gerührte Fermentatoren

Amoabediny, Ghassem (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Ghassem Amoabediny

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

Umfanggetr. Zählung : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-10-06

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-16592
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61484/files/Amoabediny_Ghassem.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; shaken bioreactor (frei) ; small escale culture (frei) ; biotechnology (frei) ; fermental (frei) ; carbon dioxide (frei) ; microorganism (frei) ; scale up (frei) ; online monitoring (frei) ; CO2 sensitivity (frei) ; unsteady state (frei) ; modeling (frei) ; gas transfer (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Geschüttelte Bioreaktoren im kleinen Maßstab (z.B. Schüttel-Kolben), üblicherweise mit verschiedenen Arten von Steril-Verschlüssen ausgestattet, sind sehr nützliche Werkzeuge in der Biotechnologie. Der Gas-Transfer-Koeffizient der Steril-Verschlüsse spielt eine wichtige Rolle in der Belüftung der geschüttelten Bioreaktoren. Die Größe von hängt vom durchschnittlichen Diffusions-Koeffizienten des Sauerstoffs , von den verschiedenen Längen und/oder auch vom Durchmesser des Kolben-Halses ab. Aus diesem Grund wurden für diese Studie mit Watte versehene Röhrchen verschiedener Längen und / oder Durchmesser für einen speziellen Schüttel-Kolben, einem so genannten Ventilations-Kolben, eingesetzt. Der Gas-Transfer durch den Steril-Verschluss wurde charakterisiert. In allen Ventilations-Kolben wurden konstante Werte für die jeweiligen CO2 und O2 Diffusions-Koeffizienten nachgewiesen. Unter Zuhilfenahme dieser Werte und der Geometrie der Kolbenhälse konnte ein breites Spektrum von Werten für in den Ventilations-Kolben hergeleitet werden. Da bei abnehmendem eine Reduzierung der O2-Konzentration bei gleichzeitiger Akkumulation von CO2 in der Gasphase der geschüttelten Bioreaktoren einhergeht, ist ein gutes Verständnis ebenso wie realistische Einschätzungen den Gas-Transfer in geschüttelten Bioreaktoren betreffend von Vorteil, um eventuell auftretende Sauerstoff-Limitation bzw. Kohlendioxid-Inhibition der Mikroben-Kultur vermeiden zu können. In dieser Studie wurde ein Gas-Transfer-Modell unter unsteady-state Bedingungen für Schüttel-Kolben entwickelt und dieses experimentell für ein breites Spektrum von Gas-Transfer-Koeffizienten untersucht. Die angewendete Herangehensweise basiert auf dem Modell von Henzler und Schedel [23], welches die örtlich veränderlichen Gas-Partial-Drücke innerhalb des Steril-Verschlusses unter Einfluss der lokalen Gas-Diffusions-Koeffizienten und des konvektiven Stefan-Flow’s beschreibt. Zur weiteren einfachen Bearbeitung wird der resultierende Gesamt-Massen-Transfer-Koeffizient als Funktion des Sauerstofftransfers durch den Steril-Verschluss durch eine empirische Gleichung beschrieben. Diese Gleichung wird in ein Simulations-Modell eingeführt, das die Gas-Partial-Drücke im Kopf-Bereich des Kolbens berechnet. Zudem werden die Gas-Transfer-Raten durch den Steril-Verschluss und die Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche innerhalb des Kolbens angegeben. Simulationen deuten darauf hin, dass die Vernachlässigung des Sauerstoff-Gehalts im Kopf-Bereich des Kolbens unter Anfangsbedingungen (einfache steady-state-Annahme) zu einer Unterschätzung des Sauerstoff-Transfers in die flüssige Phase führt. Das Ausmaß des Fehlers hängt von den jeweiligen Bedingungen ab. Eine gute Übereinstimmung des eingeführten unsteady-state-Modells mit den experimentellen Ergebnissen für das Sulfit und das biologische System bestätigten die Validität und die Nützlichkeit der vorgeschlagenen unsteady-state Herangehensweise. Darüber hinaus wurde eine neue und einfache Methode zur Quantifizierung der CO2-Empfindlichkeit von Mikro-Organismen in Ventilations-Kolben (unter Benutzung deren Eigenschaften) untersucht. Die Unterschiede zwischen den Werten von akkumuliertem CO2 und der Sauerstoff-Konzentration in einer Ventilations-Kolben-Kultur bestätigten die Validität der Methode. Die Auswirkung von Belüftung auf die Abfuhr von CO2 aus der Fermentations-Brühe wurde dokumentiert. Zudem wurde die neue Methode, basierend auf Daten der Oxygen Transfer Rate (OTR), welche mit Hilfe eines RAMOS-Systems (Respiratory Activity Monitoring System) bei verschiedenen Belüftungs-Raten aufgenommen wurde, als eine Online-Überwachungs-Methode für die CO2-Empfindlichkeit von Mikroorganismen in geschüttelten Bioreaktoren entwickelt. Ein maximaler Wert von 12% für die akkumulierten CO2 -Konzentrationen wurde in beiden o.g. Methoden hergeleitet, vorausgesetzt, dass das Kultivierungs-System unter optimalen Bedingungen ausgeführt wurde (z.B. das selbe Füllvolumen (15ml), angemessene Medien- und Puffer-Kapazitäten zur pH-Kontrolle, der geeignete OTR-Wert (0,05), Betrieb unter nicht vorhandener Sauerstoff-Limitation und RQ 1). Die geeigneten Betriebs-Bedingungen konnten unter Nutzung des unsteady-state-Modells vorhergesagt werden. Unter Anwendung der erwähnten Methoden konnte ein signifikanter Einfluss des akkumulierten CO2 auf die Biomasse-Konzentration, Wachstumsrate und Lysin-Produktion der Fermentation mit C. glutamicum DM 1730 nachgewiesen werden. Des Weiteren wiesen die experimentellen Ergebnisse bei Arxula adeninivorans LS3 und Hansenula polymorpha (WT ATCC 34438 und RB11-FMD-GFP) darauf hin, dass das CO2 keinen Einfluss auf diese Mikroorganismen hatte. Pseudomonas fluorescens DSM 50090 auf Hefe-Extrakt + Glucose und Corynebacterium glutamicum ATCC WT13032 auf L-Lactat reagierten sehr empfindlich auf CO2, was gut mit Literatur-Werten übereinstimmt. Einige der wichtigen Vorteile der neuen Methoden umschließen Einfachheit, geringere Kosten und Zeitaufwand, einfache Handhabung und das Erhalten von Resultaten, welche mit Fermentationen im großen Maßstab vergleichbar sind. Außerdem wurde eine neue Belüftungs-Strategie, ausgehend von den Ventilations-Kolben, hin zu einem belüfteten Fermentations-System (z.B. durch Messung im Kolben und im gerührten Fermenter) entwickelt, basierend auf denselben Gas-Konzentrationen (O2 und CO2) im Kopf-Raum dieser Behälter. Unter Anwendung dieser Methode konnten die Konzentrationen von CO2 und O2 in der Gasphase, welche in (belüfteten) Kolben und gerührten Bioreaktoren gemessen wurden, mit denen verglichen werden, die in den Ventilations-Kolben nachgewiesen worden sind. Schließlich wurde noch in dieser Studie eine neue Scale-Up Methode von Schüttelkolben zu gerührten Fermentern, im Hinblick auf die Auswirkungen von CO2-Ventilation, die Belüftungs-Strategie betreffend, untersucht. Selbst bei grundauf verschiedenen Belüftungs-Einstellungen wurden ähnliche Tendenzen für Biomasse-Konzentration, L-Lysin-Produktion, maximalem OTR und spezifischer Wachstumsrate bei der Fermentation des Modell-Organismus C. glutamicum DM1730 für beide Maßstäbe nachgewiesen. Folglich konnte die Möglichkeit einer Maßstabs-Vergrößerung von Ventilations-Kolben hin zu gerührten Bioreaktoren, basierend auf dem Kriterium der CO2-Ventilation, demonstriert werden.

Small scale shaken bioreactors (e.g. shake flasks) traditionally equipped with different types of sterile closures are very useful tools in biotechnology. The gas transfer coefficient of the sterile closures (kplug) plays an important role in aeration of shaken bioreactors. The value of kplug depends on the average diffusion coefficient of oxygen (DeO2) and different lengths or/and diameters of the neck of flask. Therefore, in this study, a series of pipes with different lengths or/and diameters filled with cotton for a special shake flask, so-called ventilation flask, were employed. The gas transfer through the sterile closure of the ventilation flasks was characterized. Constant values of CO2 and O2 diffusion coefficient were found in all of the ventilation flasks. Considering these values and the neck geometry, a variety of kplug in ventilation flasks were obtained. Since, decreasing kplug causes a reduction of O2 concentration and an accumulation of CO2 in the gas phase of the shaken bioreactors, a realistic understanding and estimation of gas transfer in shaken bioreactors is advantageous to avoid oxygen limitation or carbon dioxide inhibition of a microbial culture. In this study, an unsteady state gas transfer model for shake flasks was developed and experimentally investigated for a wide range of gas transfer coefficients (kplug). The introduced approach is based on the model of Henzler and Schedel [23], which describes the spatially-resolved gas partial pressures inside the sterile closure, affected by the local gas diffusion coefficients and convective Stefan flow. For further easy processing, the resulting total mass transfer coefficient (kplug) is described as a function of the mass flow through the sterile plug (OTRplug) by an empirical equation. This equation is introduced into a simulation model which calculates the gas partial pressures in the head space of the flask. Additionally, the gas transfer rates through the sterile closure and gas-liquid interface inside the flask are provided. Simulations indicate that neglecting the oxygen in the head space volume of the flask at initial conditions (simple steady state assumption) may lead to an underestimation of the oxygen transfer into the liquid phase. The extension of error depends on the conditions. A good agreement between the introduced unsteady state model and experimental results for the sulfite and biological system confirmed the validity and usefulness of the proposed unsteady state approach. Moreover, a novel and easy method for quantification of CO2-sensitivity of microorganisms in ventilation flask was investigated, using the properties of ventilation flasks. The differences between the values of accumulated CO2 and concentration of oxygen in a culture system in ventilation flasks confirmed the validity of method. The effect of aeration on the removal of CO2 from the fermentation broth has been documented. Additionally, based on the data of the oxygen transfer rate (OTR), obtained by a Respiratory Activity Monitoring System (RAMOS) under a variety of specific aeration rates, the purposed new method was developed as an online monitoring method for CO2 sensitivity of microorganisms in shaken bioreactors.A maximum accumulated CO2 concentration of 12% was derived in both above methods, provided that the cultivation system is carried out under optimal conditions (e.g. the same filling volume (15m1), appropriate media and buffer capacity to control the pH, the suitable OTR (0.05 mol/l/h), operating under non oxygen limitation and RQ¡Ö1). The proper operation condition could be predicted using the unsteady state model. Applying these mentioned method, a significant effect of accumulated CO2 on the biomass concentration, growth rate and lysine product in the fermentation of C. glutamicum DM 1730 was found. Furthermore, the experimental results on Arxula adeninivorans LS3 and Hansenula polymorpha (WT ATCC 34438 and RB11-FMD-GFP) indicated that the CO2 had no effect on these microorganisms. Pseudomonas fluorescens DSM 50090 on yeast extract + glucose and Corynebacterium glutamicum ATCC WT13032 on L-lactate were found to be especially sensitive to CO2, which agree with literature. Some of the important advantages of the new methods are simplicity, lower cost and time consumption, easy of handling and producing similar results as large scale fermentation. Besides, a new aeration strategy from the ventilation flasks to an aerated fermentation system (e.g. measuring flask and stirred tank fermentor) was developed, based on the same concentration of gas compounds (O2 and CO2) in the headspace of these vessels. By applying this method, the concentrations of CO2 and O2 in the gas phase obtained from measuring (aerated) flasks and stirred tank bioreactors were comparable to those obtained from ventilation flasks. Finally in this study a new scale up method from shake flasks to stirred tank bioreactors, concerning the aeration strategy, was investigated based on the effect of CO2 ventilation. Even for different sets of aerations, similar trends were found for the values of the biomass concentration, L-lysine formation, maximum OTR and specific growth rate for fermentation of C .glutamicum DM 1730 as a model organism, in the both scales. Thus, the possibility of scaling up from ventilation flasks to stirred tank bioreactors based on CO2 ventilation criterion was demonstrated.

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