Selektive Markierung von Glykokonjugaten mit modifizierten Donorzuckern als Substrate von Glykosyltransferasen und Glykosidasen

Namdjou, Darius-Jean; Hartmeier, Winfried; Elling, Lothar

doi:1544

Selektive Markierung von Glykokonjugaten mit modifizierten Donorzuckern als Substrate von Glykosyltransferasen und Glykosidasen

Namdjou, Darius-Jean (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Darius-Jean Namdjou

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

UmfangXXII, 270 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Elling, Lothar (Thesis advisor)^RWTH* ; Hartmeier, Winfried (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-04-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-15449
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61124/files/61124.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Glykokonjugate (frei) ; Enzymatische Oxidation (frei) ; Autoaggressionskrankheit (frei) ; Markierung (frei) ; Transferasen (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Kernziel dieser Arbeit war die selektive Markierung krankeitsrelevanterGlykokonjugatstrukturen durch Glykosyltransferasen. Besonderes Augenmerk sollte auf die Untergalactosylierung der N-Glykane des IgG gelegt werden. Diese Struktur wird in der Literatur mit Rheumatoider Arthritis assoziiert. Für das selektive Labelling sollte der modifizierte Nukleotidzucker UDP-6-biotinyl-Gal als Donorsubstrat verwendet werden. Die in der AG Elling für das selektive Labelling vorhandenen Konstrukte der humanen beta4Gal-T1 sollten charakterisiert werden. Mit einem der Konstrukte sollte eine Mutagenisierung durchgeführt werden, um auch ein Labelling mit UDP-6-biotinyl-GalNAc zu ermöglichen. Darüberhinaus sollte gezeigt werden, ob die Technik des selektiven Transfers auch auf die Klasse der Glykosidasen auszuweiten ist.Die grundlegende Zielsetzung der hier vorliegenden Arbeit konnte erfüllt werden. So wurde zunächst die Synthese und vor allem die Isolierung des für den selektiven Transfer genutzten UDP-6-biotinyl-Gal optimiert. Ebenfalls erfolgreich war die Mutagenisierung der humanen beta4Gal-T1. Durch eine gezielte Punktmutation konnte ein Enzym erhalten werden, welches eine UDP-GalNAc-Transferaktivität aufweist. Zusammen mit drei Konstrukten der humanen beta4Gal-T1, der freien, luminalen und His6-TagPropeptid-beta4Gal-T1 wurde auch die Mutante His6-TagPropeptid-beta4Gal-T1(Y284L) charakterisiert. Es wurde das Substratspektrum, das pH-Optimum sowie die Restaktivität mit verschiedenen Metallionen untersucht. Darüberhinaus wurden alle Konstrukte kinetisch charakterisiert. Dabei konnten überraschenderweise Konstrukte gefunden werden, die, je nach Spezifität UDP-6-biotinyl-Gal auf den Monosaccharid-Akzeptor GlcNAc beta1-Bn oder auf das Glykoprotein Ratten IgG übertragen. Ein Transfer von UDP-6-biotinyl-GalNAc mit der His6-TagPropeptid-beta4Gal-T1(Y284L) blieb aus. Dennoch könnte das Enzym im Hinblick auf eine chemoselektive Kopplung, bei der zunächst ein eine geringe Modifikation tragendes UDP-GalNAc auf ein Glykokonjugat übertragen würde, noch wertvoll sein. Mit den Konstrukten freie und luminale beta4Gal-T1 konnte ein Transfer-Assay auf untergalactosylierte Strukturen erfolgreich durchgeführt werden. Mit dem Modellprotein IgG der Ratte wurden die Transfer- und Nachweisbedingungen optimiert. So konnte ein Sandwich-ELSA als Nachweis-Methode etabliert werden. Im Weiteren konnte die unterschiedliche Untergalactosylierung der N-Glykane der IgG verschiedener Spezies erfolgreich nachgewiesen werden. Durch Nachweis des Erfolgs des selektiven Transfers und der Möglichkeit, verschieden hohe Untergalactosylierungen zu unterscheiden, war das hochrangigste Ziel dieser Arbeit realisiert. Zudem wurde eine Strategie zur Quantifizierung des Grades der Biotinylierung verschiedener IgGs etabliert. Es zeigte sich, dass die freien GlcNAc-Reste der N-Glykane des Human IgG annähernd quantitativ biotinyliert werden können. Die einfache Nachweistechnik im Mikrotiterplattenformat durch den Sandwich-ELSA sowie der hohe Biotinylierungsgrad wecken große Hoffnungen in Richtung einer Frühdiagnostik der Rheumatoiden Arthritis. Mit pNP-6-biotinyl-Gal(NAc) wurden potentielle Substrate des selektiven Transfers durch Glykosidasen im 100 mg-Maßstab synthetisiert und isoliert. Eine erfolgreiche Hydrolyse oder ein Transfer dieser Derivate blieb allerdings aus. Jedoch konnten auch die Oxidationsprodukte, pNP-6-oxo-Gal(NAc), isoliert werden. Für beide Zucker konnte nachgewiesen werden, dass sie Substrate von Glykosidasen sind. Transglycosylierung von pNP-6-oxo-GalNAc mit GlcNAc und nachfolgende chemische Oxidation an der Aldehyd-Funktion erbrachte einen der besten bisher bekannten Hochaffinitäts-Liganden für natürliche Killerzell-Rezeptoren.

The main goal of this Ph. D. thesis has been the selective labelling of disease-related glycoconjugate structures with glycosyltransferases. In this context the main focus has been on the agalacto structures of the N-glycans of IgG. These structures are associated with rheumatoid arthritis as described in the literature. The modified nucleotide sugar UDP-6-biotinyl-Gal should be used for the selective labelling experiments. Several constructs of human beta4Gal-T1, available in our research group for the selective labelling, should be characterized. With one of the mentioned constructs a mutagenesis should be performed to make a labelling with UDP-6-biotinyl-GalNAc possible. This nucleotide sugar could not yet be transferred successfully. Further on it should also be shown if the technique of selective transfer can be applied to the enzyme class of glycosidases. The main goal of this Ph.D. thesis could be fulfilled. First the synthesis and most important the isolation of UDP-6-biotinyl-Gal have been optimized. Instead of a two step procedure for purification UDP-6-biotinyl-Gal can now be obtained in a one step isolation process and with greater purity. The mutagenesis of human beta4Gal-T1 has also been successful. By bringing in a point mutation we have been able to obtain an enzyme which has a UDP-GalNAc transfer activity. Together with three constructs of human beta4Gal-T1, the free, luminal and His6-TagPropeptid-beta4Gal-T1, the mutant His6-TagPropeptid-beta4Gal-T1(Y284L) has also been characterized. The substrate spectrum, the pH optimum as well as the rest activity with several metal ions has been examined. Further all constructs have been characterized kinetically. Rather surprisingly we could find constructs that according to their specifity can transfer UDP-6-biotinyl-Gal to the monosaccharide acceptor GlcNAc beta1-Bn or to the glycoprotein rat IgG. A transfer of UDP-6-biotinyl-GalNAc with His6-TagPropeptid-beta4Gal-T1(Y284L) could not be demonstrated. Nevertheless the mutant can be of great value for the selective coupling approach. In this approach an only slightly modified UDP-GalNAc is transferred to a glycoconjugate and then chemoselectively coupled to a molecule bearing a reporter group, e.g. biotin. With the constructs free and luminal beta4Gal-T1 a transfer assay on agalacto structures has been performed successfully. The conditions of transfer and detection have been optimized with the model protein rat IgG. A sandwich ELSA has been established as the detection method. Further the quantitative differences in the agalactosylation of the IgG N-glycans of several species have been shown successfully. By the proof of success of selective transfer and the ability to discriminate between different levels of agalactosyltaion the main goal of this work has been met. In addition a strategy for the quantification of the biotinylation level of different IgGs has been established. It could be shown that the agalactosylated N-glycans of human IgG can nearly be biotinylated quantitatively. The simple detection method by the sandwich ELSA in microtiter plate format and the high level of biotinylation rise high expectations in the direction of an early diagnosis of rheumatoid arthritis. With pNP-6-biotinyl-Gal(NAc) potential substrates of the selective transfer with glycosidases have been synthesized and isolated on a 100 mg-scale. Hydrolysis or transfer could not be demonstrated. However the oxidation products pNP-6-oxo-Gal(NAc) could also be isolated. It could be shown for both sugars that they are substrates of glycosidases. A transglycosylation of pNP-6-oxo-GalNAc with GlcNAc and subsequent chemical oxidation at the aldehyde moiety has led to one of the best so far known high affinity ligands for natural killer cell receptors.

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