Modulation of Nrf2-mediated oxidative stress response in bovine granulosa cells and preimplantation embryos

Abstract

Nrf2 is a redox sensitive transcription factor involved in regulation of antioxidants defense mechanism against various stressors. Maintaining reactive oxygen species (ROS) within cellular homeostatic levels is crucial for the female reproductive performance and ovarian ability to develop a competent oocyte capable to be fertilized and developed to competent embryo. However, Nrf2 is found to be regulated at transcriptional and posttranscriptional levels and various epigenetic mechanisms including DNA methylation, histone modifications and miRNAs. Therefore, this dissertation aims to assess the potential role of noncoding miRNAs as endogenous and quercetin as exogenous regulators of Nrf2 pathway in bovine granulosa cells and preimplantation embryos. For this, two main experiments were conducted; where bovine granulosa cells were used for modulation of miRNAs (miR-28, 153 and miR-708) targeting the bovine Nrf2 and supplementation of quercentin to investigate the regulatory mechanisms of the Nrf2 antioxidant system. In addition, cultured cells exposed to oxidative stress conditions induced by hydrogen peroxide (H₂O₂) in those cells. Cells of all experimental groups were subjected to ROS level, mitochondrial activity and cell proliferation assays as well as mRNA and protein expression analyses. In the second experiment, bovine embryos were cultured in media supplemented with quercetin under high oxygen tension (20 %). Blastocysts were subjected to ROS level, mitochondrial activity, mRNA expression and protein analysis. Overexpression of miR-153, miR-28 and miR-708 reduced the expression pattern of Nrf2 at transcriptional and translational levels under physiological and oxidative stress conditions. Moreover, overexpression of miR-153 and miR-28\708 showed higher ROS accumulation, lower mitochondrial activity and cellular proliferation. Furthermore, quercetin supplementation in culture media showed a protective role on bovine granulosa cells and preimplantation embryos against oxidative stress induced by H₂O₂ and high oxygen level, respectively through activation of Nrf2 machinery leading to reduce ROS accumulation, increased mitochondrial activity and cellular proliferation and embryonic total cell number. These findings highlighted the regulatory mechanisms of Nrf2 mediated oxidative stress response pathway in bovine granulosa cells, preimplantation embryos and indicate the potential application of those regulatory mechanisms in future fertility treatment strategies to enhance ovarian functionality and embryo quality under suboptimal conditions.

<strong>Beeinflussung der Nrf2-vermittelten oxidativen Stressreaktion in bovinen Granulosazellen und Präimplantationsembryonen</strong><br /> Nrf2 ist ein redoxsensitiver Transkriptionsfaktor, der an der Regulierung des antioxidativen Abwehrmechanismus gegen verschiedene Stressoren beteiligt ist. Die Regulation der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) innerhalb der zellulären Homöostase ist entscheidend für die weibliche Reproduktionsleistung und die Fähigkeit der Eierstöcke kompetente Eizellen zu entwickeln, die befruchtungsfähig sind und sich zu kompetenten Embryonen entwickeln. Allerdings wurde festgestellt, dass Nrf2 auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene sowie durch verschiedene epigenetische Mechanismen - DNA-Methylierung, Histonmodifikationen und miRNAs - reguliert wird. Daher ist das Ziel der Dissertation die potenzielle Rolle von nicht-kodierenden miRNAs als endogene und die von Quercetin als exogene Regulatoren des Nrf2-Signalwegs in bovinen Granulosazellen und Präimplantationsembryonen zu bewerten. Dazu wurden zwei Hauptexperimente durchgeführt in denen bovine Granulosazellen eingesetzt wurden, um zum einen die Beeinflussung von Nrf2 Ziel-miRNAs (miR-28, miR-153 und miR-708) und zum anderen die regulierende Wirkung von Quercetin auf das Nrf2 antioxidative System zu untersuchen. Darüber hinaus wurden die kultivierten Zellen durch Wasserstoffperoxid (H₂O₂) oxidativen Stressbedingungen ausgesetzt. Mit den Zellen aller experimentellen Gruppen wurden ROS-, mitochondriale Aktivitäts- und Zellproliferationsassays sowie mRNA- und Proteinexpressionsanalysen durchgeführt. Im zweiten Experiment wurden Rinderembryonen mit Quercetin versetztem Medium und in einer hohen Sauerstoffumgebung (20 %) kultiviert. Mit den Blastozysten wurden ebenfalls ROS-, mitochondriale Aktivitäts-, mRNA- und Proteinexpressionsanalysen durchgeführt. Die Überexpression von miR-153, miR-28 und miR-708 reduzierte die Nrf2 Expression auf transkriptioneller und translationaler Ebene unter physiologischen und oxidativen Stressbedingungen. Darüber hinaus zeigte die Überexpression von miR-153, miR-28 und miR-708 eine höhere ROS-Akumulation, eine geringere mitochondriale Aktivität sowie eine geringere zelluläre Proliferationsrate. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass Quercetin im Kulturmedium eine schützende Wirkung auf bovine Granulosazellen und Präimplantationsembryonen vor oxidativem Stress hat, auch bei einer H₂O₂ Belastung und einem hohen Sauerstoffgehalt. Dies erfolgte jeweils durch die Aktivierung des Nrf2- Mechanismus sowie der daraus resultierenden Reduktion der ROS-Akkumulation und der Erhöhung der mitochondrialen Aktivität sowie der zellulären Proliferation und der embryonalen Gesamtzellzahl. Diese Ergebnisse heben zum einen die Regulationsmechanismen des Nrf2-vermittelten oxidativen Stresssignalwegs in bovinen Granulosazellen und Präimplantationsembryonen hervor und zeigen zum anderen die mögliche Anwendbarkeit dieser Mechanismen in zukünftigen Fertilitätsbehandlungsstrategien, um die Funktionalität der Eierstöcke und die embryonale Qualität unter suboptimalen Bedingungen zu verbessern.