Expression and Function of ErbB4 Splice Variants in the Central Nervous System

Abstract

Neuregulins and their cognate neuronal receptor tyrosine kinase ErbB4 (<em>avian erythroblastosis virus oncogene B4</em>) are genetically linked with an increased risk for schizophrenia. NRG/ErbB4 signaling regulates neurodevelopment, synaptic plasticity, network activity and modulates several neurotransmitter systems. Four ErbB4 isoforms are generated by alternative splicing in the juxtamembrane (JMa and JMb) and cytoplasmic region (Cyt-1 and Cyt-2). These isoforms mediate unique downstream signaling pathways exerting divergent biological functions. Although the expression of ErbB4 variants is altered in postmortem brains of schizophrenia patients, little is known about the distribution and functions of ErbB4 isoforms in the brain. This dissertation investigates the hypothesis that ErbB4 variants are differentially expressed in the central nervous system and uniquely contribute to ErbB4’s role in the brain. Using next-generation sequencing, major and rare ErbB4 variants in the mouse brain are first identified. Then, to analyze splice variants at the cellular level, a novel ultrasensitive exon-specific <em>in situ</em> hybridization approach is implemented and validated, and quantitation tools developed. I extensively describe the mRNA distribution of the four major ErbB4 variants in the mouse brain, identify spatiotemporal- and cell type-specific expression, and expand these findings to the human brain. The examination of subcellular distribution of ErbB4 protein in distinct neuronal cell types reveals that in contrast to the somatodendritic restriction of ErbB4 in cultured gamma-aminobutyric acid (GABA)ergic interneurons, ErbB4 is present on axonal projections of dopaminergic neurons, independent of the isoform. Finally, we generated isoform-specific Cyt-1 mutant mice to explore <em>in vivo</em> functions of this ErbB4 variant. Although Cyt-1 variants comprise 40% of all ErbB4 transcripts in the brain, extensive molecular, transcriptomic, neurodevelopmental, neurochemical and behavioral evaluation show modest phenotypic effects, suggesting a possible compensation throughout development or redundant functions of Cyt isoforms. These findings advance our understanding of the basic biology of ErbB4 isoforms and their pathophysiological changes in schizophrenia.

Neureguline und ihr neuronaler Tyrosinkinaserezeptor ErbB4 (avian erythroblastosis virus oncogene B4) sind genetisch mit einem erhöhtem Risiko für Schizophrenie assoziiert. NRG/ErbB4 Signalübertragung reguliert unter anderem die Neuronalentwicklung, synaptische Plastizität, Netzwerkaktivität und moduliert verschiedene Neurotransmittersysteme. Vier ErbB4 Isoformen entstehen durch alternatives Spleißen in der juxtamembranen (JMa und JMb) und zytoplasmatischen Region (Cyt-1 und Cyt-2). Diese Isoformen vermitteln spezifische Signalwege und damit unterschiedliche biologische Funktionen. Obwohl die Expression von ErbB4-Spleißvarianten in postmortalen Gehirnen von Schizophrenie-Patienten verändert ist, ist wenig über ihre Verteilung oder Funktionen im Gehirn bekannt. Diese Dissertation untersucht die Hypothese, dass ErbB4-Spleißvarianten im zentralen Nervensystem differenziell exprimiert sind und auf spezifische Weise zu den bekannten ErbB4-Funktionen beitragen. Mit Sequenziermethoden der nächsten Generation werden zunächst Haupt- und seltene ErbB4-Spleißvarianten festgelegt. Um Spleißvarianten auf zellulärer Ebene zu analysieren, wird dann eine neue ultrasensitive und Exon-spezifische <em>in situ</em> Hybridisierungsmethode etabliert und validiert, sowie quantitative Hilfsmittel entwickelt. Ich beschreibe ausführlich die mRNA Verteilung der vier ErbB4 Hauptspleißvarianten im Mausgehirn, einschließlich ihrer neuroanatomischen, zeitlichen und Zelltyp-spezifischen Expression, und erweitere diese Erkenntnisse auf das menschliche Gehirn. Die Untersuchung der subzellulärer Verteilung von ErbB4 Protein in verschiedenen neuronalen Zelltypen ergibt, dass ErbB4 im Gegensatz zur somatodendritischen Beschränkung in kultivierten gamma-Aminobuttersäure (GABA)ergen Interneuronen in axonalen Fortsätzen von dopaminergen Neuronen zu finden ist; unabhängig von der Isoform. Schließlich erzeugten wir eine Isoform-spezifische Cyt-1 Mauslinie, um die <em>in vivo</em> Funktion dieser ErbB4-Spleißvariante zu charakterisieren. Obwohl Cyt-1 Isoformen 40% aller ErbB4-Transkripte im Gehirn darstellen, offenbaren die umfangreichen molekularen, transkriptomischen, entwicklungsbiologischen, neurochemischen und Verhaltensstudien kaum Phänotypen, möglicherweise als Resultat kompensatorischer Prozesse während der Entwicklung oder Redundanz von Cyt Isoformen. Diese Erkenntnisse vertiefen unser biologisches Grundlagenverständnis von ErbB4 Isoformen und ihrer pathophysiologischen Veränderungen in Schizophrenie.