Schlüsselenzyme der Methanogenese und der Energiekonservierung im Darmbewohner Methanomassiliicoccus luminyensis
Schlüsselenzyme der Methanogenese und der Energiekonservierung im Darmbewohner Methanomassiliicoccus luminyensis
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DissertationDate of Exam
02.07.2018Date of Publication
30.10.2018Advisor
Deppenmeier, UweCo-Referee
Dahl, ChristianeMetadata
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Abstract
Die vorliegende Arbeit befasste sich mit der Untersuchung des im menschlichen Darm lebenden, methanogenen Archaeons Methanomassiliicoccus luminyensis. Da der Organismus immer noch der einzige in Reinkultur verfügbare Vertreter der Ordnung Methanomassiliicoccales ist, war dessen Erforschung aus verschiedenen Gründen relevant. Zum einen ist in M. luminyensis ein neuartiger Methanogeneseweg realisiert, was die Analyse des Organismus aus biochemischer Sicht interessant macht. Zum anderen ist die Untersuchung dieses methanogenen Archaeons wichtig, da M. luminyensis als potentielles Probiotikum im Zusammenhang mit der Erkrankung Trimethylaminurie in Frage kommt.
Im Rahmen von Wachstumsanalysen konnte gezeigt werden, dass M. luminyensis die methylierten Substrate, Methanol und Methylamine, mit H2 als Elektronendonor zu äquimolaren Methanmengen umsetzt. Durch Optimierung der Wachstumsbedingungen wurde eine maximale OD600 von 0,5 erreicht, die bisher nicht mit M. luminyensis erzielt werden konnte, wobei zum Erreichen dieser Zelldichte eine Konzentration an Methylgruppenäquivalenten von mindestens 110 mM nötig war. M. luminyensis nutzte Acetat als Kohlenstoffquelle und inkorporierte diese Verbindung während der exponentiellen Phase. Bei der Untersuchung von Methanol- und TMA-adaptierten, ruhenden M. luminyensis-Zellen fiel auf, dass diese immer Methanol mit der höchsten Rate zu Methan umsetzten. Waren die Zellen an Methanol angepasst, war überraschenderweise keine Methanogenese ausgehend von Methylaminen + H2 zu verzeichnen. Dies deutete darauf hin, dass den Zellen die enzymatische Ausstattung zur Verstoffwechselung von Methylaminen fehlte und Methanol generell als Substrat bevorzugt wurde. Zur Bestätigung der Hypothese wurden Transkriptionsstudien durchgeführt, die zeigten, dass die Gene, die für Enzyme der Methanol-Demethylierung kodieren, unabhängig vom Wachstumssubstrat hohe Transkriptmengen aufwiesen. Im Gegensatz dazu lagen von Genen, die für Enzyme der Methylamin-Demethylierung kodieren, nur dann hohe mRNA-Mengen vor, wenn die Anzucht der Zellen auf dem entsprechenden Substrat erfolgte. Somit wiesen die Versuche darauf hin, dass eine konstitutive Expression der Gene, die für Proteine der Methanol-Verstoffwechselung kodieren, vorlag, wohingegen die Expression der Methylamin-spezifischen Gene einer stringenten Regulation unterlag.
M. luminyensis zeigt im Vergleich zu anderen methanogenen Organismen eine ungewöhnliche Enzymausstattung und es war nicht bekannt, wie der Organismus mit diesen Enzymen Energie konserviert. Bei Wachstum auf Methanol + H2 lagen von den Genen, die für den Fpo-Komplex, den löslichen Mvh/Hdr-Komplex und die Untereinheit HdrD kodieren, signifikante mRNA-Mengen vor. Demgegenüber zeigten die Gene, die für die drei membranständigen Hydrogenasen kodieren, nur sehr geringe Transkriptabundanzen. Das Cytoplasma von M. luminyensis zeigte hohe Heterodisulfidreduktase- und Hydrogenase-Aktivitäten, welche durch den Mvh/Hdr-Komplex hervorgerufen wurden. Dies weist auf eine wichtige Funktion des Enzymkomplexes im Energiestoffwechsel von M. luminyensis hin. Die Membranfraktion verfügte dagegen über eine sehr geringe Hydrogenase-Aktivität, sodass membranständige Hydrogenasen bei der Energiekonservierung offensichtlich keine Rolle spielen. Die Untereinheit HdrD der eigentlich membranständigen Heterodisulfidreduktase HdrDE, welche aus methanogenen Archaeen mit Cytochromen bekannt ist, bildet in M. luminyensis ein funktionelles Enzym, das Heterodisulfidreduktase-Aktivität aufweist. Das Enzym konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation heterolog überproduziert und enzymatisch charakterisiert werden, wobei HdrD eine spezifische Aktivität von 4,9 U mg-1 und einen KM-Wert von 20,1 µM zeigte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass M. luminyensis nur Protonen als Kopplungsionen zur Energiekonservierung an der Cytoplasmamembran nutzt. M. luminyensis-Membranen, die den ‚kopflosen‘ Fpo-Komplex enthalten, konnten in Kombination mit der Untereinheit HdrD Fdred als Elektronendonor nutzen, sodass eine Fpo/HdrD-Komplexbildung postuliert wurde.
Im Rahmen von Wachstumsanalysen konnte gezeigt werden, dass M. luminyensis die methylierten Substrate, Methanol und Methylamine, mit H2 als Elektronendonor zu äquimolaren Methanmengen umsetzt. Durch Optimierung der Wachstumsbedingungen wurde eine maximale OD600 von 0,5 erreicht, die bisher nicht mit M. luminyensis erzielt werden konnte, wobei zum Erreichen dieser Zelldichte eine Konzentration an Methylgruppenäquivalenten von mindestens 110 mM nötig war. M. luminyensis nutzte Acetat als Kohlenstoffquelle und inkorporierte diese Verbindung während der exponentiellen Phase. Bei der Untersuchung von Methanol- und TMA-adaptierten, ruhenden M. luminyensis-Zellen fiel auf, dass diese immer Methanol mit der höchsten Rate zu Methan umsetzten. Waren die Zellen an Methanol angepasst, war überraschenderweise keine Methanogenese ausgehend von Methylaminen + H2 zu verzeichnen. Dies deutete darauf hin, dass den Zellen die enzymatische Ausstattung zur Verstoffwechselung von Methylaminen fehlte und Methanol generell als Substrat bevorzugt wurde. Zur Bestätigung der Hypothese wurden Transkriptionsstudien durchgeführt, die zeigten, dass die Gene, die für Enzyme der Methanol-Demethylierung kodieren, unabhängig vom Wachstumssubstrat hohe Transkriptmengen aufwiesen. Im Gegensatz dazu lagen von Genen, die für Enzyme der Methylamin-Demethylierung kodieren, nur dann hohe mRNA-Mengen vor, wenn die Anzucht der Zellen auf dem entsprechenden Substrat erfolgte. Somit wiesen die Versuche darauf hin, dass eine konstitutive Expression der Gene, die für Proteine der Methanol-Verstoffwechselung kodieren, vorlag, wohingegen die Expression der Methylamin-spezifischen Gene einer stringenten Regulation unterlag.
M. luminyensis zeigt im Vergleich zu anderen methanogenen Organismen eine ungewöhnliche Enzymausstattung und es war nicht bekannt, wie der Organismus mit diesen Enzymen Energie konserviert. Bei Wachstum auf Methanol + H2 lagen von den Genen, die für den Fpo-Komplex, den löslichen Mvh/Hdr-Komplex und die Untereinheit HdrD kodieren, signifikante mRNA-Mengen vor. Demgegenüber zeigten die Gene, die für die drei membranständigen Hydrogenasen kodieren, nur sehr geringe Transkriptabundanzen. Das Cytoplasma von M. luminyensis zeigte hohe Heterodisulfidreduktase- und Hydrogenase-Aktivitäten, welche durch den Mvh/Hdr-Komplex hervorgerufen wurden. Dies weist auf eine wichtige Funktion des Enzymkomplexes im Energiestoffwechsel von M. luminyensis hin. Die Membranfraktion verfügte dagegen über eine sehr geringe Hydrogenase-Aktivität, sodass membranständige Hydrogenasen bei der Energiekonservierung offensichtlich keine Rolle spielen. Die Untereinheit HdrD der eigentlich membranständigen Heterodisulfidreduktase HdrDE, welche aus methanogenen Archaeen mit Cytochromen bekannt ist, bildet in M. luminyensis ein funktionelles Enzym, das Heterodisulfidreduktase-Aktivität aufweist. Das Enzym konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation heterolog überproduziert und enzymatisch charakterisiert werden, wobei HdrD eine spezifische Aktivität von 4,9 U mg-1 und einen KM-Wert von 20,1 µM zeigte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass M. luminyensis nur Protonen als Kopplungsionen zur Energiekonservierung an der Cytoplasmamembran nutzt. M. luminyensis-Membranen, die den ‚kopflosen‘ Fpo-Komplex enthalten, konnten in Kombination mit der Untereinheit HdrD Fdred als Elektronendonor nutzen, sodass eine Fpo/HdrD-Komplexbildung postuliert wurde.
Subjects
Methanogenese, Energiekonservierung, Archaea, Archaeen, Heterodisulfidreduktasen, Methan, Methanomassiliicoccales
Classification (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieKröninger, Lena: Schlüsselenzyme der Methanogenese und der Energiekonservierung im Darmbewohner Methanomassiliicoccus luminyensis. - Bonn, 2018. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-51440
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-51440
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Im Rahmen von Wachstumsanalysen konnte gezeigt werden, dass M. luminyensis die methylierten Substrate, Methanol und Methylamine, mit H2 als Elektronendonor zu äquimolaren Methanmengen umsetzt. Durch Optimierung der Wachstumsbedingungen wurde eine maximale OD600 von 0,5 erreicht, die bisher nicht mit M. luminyensis erzielt werden konnte, wobei zum Erreichen dieser Zelldichte eine Konzentration an Methylgruppenäquivalenten von mindestens 110 mM nötig war. M. luminyensis nutzte Acetat als Kohlenstoffquelle und inkorporierte diese Verbindung während der exponentiellen Phase. Bei der Untersuchung von Methanol- und TMA-adaptierten, ruhenden M. luminyensis-Zellen fiel auf, dass diese immer Methanol mit der höchsten Rate zu Methan umsetzten. Waren die Zellen an Methanol angepasst, war überraschenderweise keine Methanogenese ausgehend von Methylaminen + H2 zu verzeichnen. Dies deutete darauf hin, dass den Zellen die enzymatische Ausstattung zur Verstoffwechselung von Methylaminen fehlte und Methanol generell als Substrat bevorzugt wurde. Zur Bestätigung der Hypothese wurden Transkriptionsstudien durchgeführt, die zeigten, dass die Gene, die für Enzyme der Methanol-Demethylierung kodieren, unabhängig vom Wachstumssubstrat hohe Transkriptmengen aufwiesen. Im Gegensatz dazu lagen von Genen, die für Enzyme der Methylamin-Demethylierung kodieren, nur dann hohe mRNA-Mengen vor, wenn die Anzucht der Zellen auf dem entsprechenden Substrat erfolgte. Somit wiesen die Versuche darauf hin, dass eine konstitutive Expression der Gene, die für Proteine der Methanol-Verstoffwechselung kodieren, vorlag, wohingegen die Expression der Methylamin-spezifischen Gene einer stringenten Regulation unterlag.
M. luminyensis zeigt im Vergleich zu anderen methanogenen Organismen eine ungewöhnliche Enzymausstattung und es war nicht bekannt, wie der Organismus mit diesen Enzymen Energie konserviert. Bei Wachstum auf Methanol + H2 lagen von den Genen, die für den Fpo-Komplex, den löslichen Mvh/Hdr-Komplex und die Untereinheit HdrD kodieren, signifikante mRNA-Mengen vor. Demgegenüber zeigten die Gene, die für die drei membranständigen Hydrogenasen kodieren, nur sehr geringe Transkriptabundanzen. Das Cytoplasma von M. luminyensis zeigte hohe Heterodisulfidreduktase- und Hydrogenase-Aktivitäten, welche durch den Mvh/Hdr-Komplex hervorgerufen wurden. Dies weist auf eine wichtige Funktion des Enzymkomplexes im Energiestoffwechsel von M. luminyensis hin. Die Membranfraktion verfügte dagegen über eine sehr geringe Hydrogenase-Aktivität, sodass membranständige Hydrogenasen bei der Energiekonservierung offensichtlich keine Rolle spielen. Die Untereinheit HdrD der eigentlich membranständigen Heterodisulfidreduktase HdrDE, welche aus methanogenen Archaeen mit Cytochromen bekannt ist, bildet in M. luminyensis ein funktionelles Enzym, das Heterodisulfidreduktase-Aktivität aufweist. Das Enzym konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation heterolog überproduziert und enzymatisch charakterisiert werden, wobei HdrD eine spezifische Aktivität von 4,9 U mg-1 und einen KM-Wert von 20,1 µM zeigte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass M. luminyensis nur Protonen als Kopplungsionen zur Energiekonservierung an der Cytoplasmamembran nutzt. M. luminyensis-Membranen, die den ‚kopflosen‘ Fpo-Komplex enthalten, konnten in Kombination mit der Untereinheit HdrD Fdred als Elektronendonor nutzen, sodass eine Fpo/HdrD-Komplexbildung postuliert wurde.},
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Im Rahmen von Wachstumsanalysen konnte gezeigt werden, dass M. luminyensis die methylierten Substrate, Methanol und Methylamine, mit H2 als Elektronendonor zu äquimolaren Methanmengen umsetzt. Durch Optimierung der Wachstumsbedingungen wurde eine maximale OD600 von 0,5 erreicht, die bisher nicht mit M. luminyensis erzielt werden konnte, wobei zum Erreichen dieser Zelldichte eine Konzentration an Methylgruppenäquivalenten von mindestens 110 mM nötig war. M. luminyensis nutzte Acetat als Kohlenstoffquelle und inkorporierte diese Verbindung während der exponentiellen Phase. Bei der Untersuchung von Methanol- und TMA-adaptierten, ruhenden M. luminyensis-Zellen fiel auf, dass diese immer Methanol mit der höchsten Rate zu Methan umsetzten. Waren die Zellen an Methanol angepasst, war überraschenderweise keine Methanogenese ausgehend von Methylaminen + H2 zu verzeichnen. Dies deutete darauf hin, dass den Zellen die enzymatische Ausstattung zur Verstoffwechselung von Methylaminen fehlte und Methanol generell als Substrat bevorzugt wurde. Zur Bestätigung der Hypothese wurden Transkriptionsstudien durchgeführt, die zeigten, dass die Gene, die für Enzyme der Methanol-Demethylierung kodieren, unabhängig vom Wachstumssubstrat hohe Transkriptmengen aufwiesen. Im Gegensatz dazu lagen von Genen, die für Enzyme der Methylamin-Demethylierung kodieren, nur dann hohe mRNA-Mengen vor, wenn die Anzucht der Zellen auf dem entsprechenden Substrat erfolgte. Somit wiesen die Versuche darauf hin, dass eine konstitutive Expression der Gene, die für Proteine der Methanol-Verstoffwechselung kodieren, vorlag, wohingegen die Expression der Methylamin-spezifischen Gene einer stringenten Regulation unterlag.
M. luminyensis zeigt im Vergleich zu anderen methanogenen Organismen eine ungewöhnliche Enzymausstattung und es war nicht bekannt, wie der Organismus mit diesen Enzymen Energie konserviert. Bei Wachstum auf Methanol + H2 lagen von den Genen, die für den Fpo-Komplex, den löslichen Mvh/Hdr-Komplex und die Untereinheit HdrD kodieren, signifikante mRNA-Mengen vor. Demgegenüber zeigten die Gene, die für die drei membranständigen Hydrogenasen kodieren, nur sehr geringe Transkriptabundanzen. Das Cytoplasma von M. luminyensis zeigte hohe Heterodisulfidreduktase- und Hydrogenase-Aktivitäten, welche durch den Mvh/Hdr-Komplex hervorgerufen wurden. Dies weist auf eine wichtige Funktion des Enzymkomplexes im Energiestoffwechsel von M. luminyensis hin. Die Membranfraktion verfügte dagegen über eine sehr geringe Hydrogenase-Aktivität, sodass membranständige Hydrogenasen bei der Energiekonservierung offensichtlich keine Rolle spielen. Die Untereinheit HdrD der eigentlich membranständigen Heterodisulfidreduktase HdrDE, welche aus methanogenen Archaeen mit Cytochromen bekannt ist, bildet in M. luminyensis ein funktionelles Enzym, das Heterodisulfidreduktase-Aktivität aufweist. Das Enzym konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation heterolog überproduziert und enzymatisch charakterisiert werden, wobei HdrD eine spezifische Aktivität von 4,9 U mg-1 und einen KM-Wert von 20,1 µM zeigte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass M. luminyensis nur Protonen als Kopplungsionen zur Energiekonservierung an der Cytoplasmamembran nutzt. M. luminyensis-Membranen, die den ‚kopflosen‘ Fpo-Komplex enthalten, konnten in Kombination mit der Untereinheit HdrD Fdred als Elektronendonor nutzen, sodass eine Fpo/HdrD-Komplexbildung postuliert wurde.},
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