Targeting cholesterol crystals in atherosclerosis with cholesterol solubilizing 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin

Abstract

Atherosclerosis is the underlying pathology of cardiovascular diseases (CVDs), the leading cause of deaths worldwide. Elevated blood cholesterol levels have been linked to this slowly progressing inflammatory disease and lowering the amount of circulating low-density lipoprotein (LDL) cholesterol is one of the most successful treatment approaches. Crystalline cholesterol deposits in the vessel wall are a hallmark of advanced atherosclerotic plaques, but they actually already occur in early stages of atherosclerosis development. Cholesterol crystals (CCs) can activate the NLRP3 inflammasome, a cytosolic multimolecular signaling complex present in innate immune cells, such as macrophages, which are the most prominent cell type in the developing atherosclerotic plaque. NLRP3 inflammasome activation results in the release of the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-18, which are key contributors to the vascular inflammation driving atherosclerosis progression. Therefore, presumably a reduction in the amount of CCs in atherosclerotic plaques could also decrease vascular inflammation and consequently atherosclerosis progression.<br /> In this study, whether 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (CD), a compound that solubilizes cholesterol and removes cholesterol from cells, is effective in reducing vascular CC deposition or removing CCs from atherosclerotic plaques and thereby preventing atherosclerosis development was investigated in mice. CD treatment indeed impaired murine atherosclerosis development, which was indicated by a reduction of atherosclerotic plaque size and CC load. Moreover, CD treatment even mediated the regression of already established atherosclerotic plaques. The molecular mechanisms of CD-mediated atheroprotection were further examined <em>in vitro</em> in macrophages. CD treatment of CC-loaded macrophages mediated the dissolution of intracellular CCs and subsequently promoted crystal-derived cholesterol esterification, efflux and metabolism to oxysterols such as 27-hydroxycholesterol. Some oxysterols function as endogenous agonists for liver X receptor (LXR) transcription factors, which in turn activate genes regulating cholesterol efflux and antiinflammatory processes. Indeed, CD treatment induced LXR-mediated transcriptional reprogramming of macrophages towards increased cholesterol efflux. Thereby, CD promoted the reverse cholesterol transport and excretion of crystal-derived cholesterol from CC-loaded macrophages in an LXR-dependent manner. Moreover, LXR transcription factor activation was required for the atheroprotective and anti-inflammatory effects of CD <em>in vivo</em> in murine atherosclerosis.<br /> This study shows that CD is atheroprotective in mice by dissolving and removing CCs from atherosclerotic plaques and by promoting the production of cholesterol-derived endogenous LXR agonists that activate anti-atherogenic transcriptional processes. Since CD treatment is already approved for clinical use by the U.S. food and drug administration (FDA), it could be directly tested in clinical trials for the prevention or treatment of human atherosclerosis.

<strong>Cholesterinkristall-Targeting in Atherosklerose mit Cholesterin lösendem 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin</strong><br /> Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Todesursache weltweit. In den meisten Fällen ist die Atherosklerose, eine progressive, chronische Entzündungskrankheit der Blutgefäße, die pathologische Ursache dieser kardiovaskulären Erkrankungen. Ein erhöhter Cholesterinspiegel im Blut gilt als wichtiger Risikofaktor für die Entstehung der Atherosklerose, und die medikamentöse Senkung von zirkulierendem LDL-Cholesterin ist derzeit eine der erfolgreichsten Behandlungsmethoden. Ablagerungen von kristallinem Cholesterin in den Gefäßwänden gelten als Merkmal fortgeschrittener atherosklerotischer Plaques. Darüberhinaus sind Cholesterinkristalle aber bereits in den frühen Entwicklungsstadien der Atherosklerose vorhanden. Makrophagen, die häufigsten und bedeutendsten Zellen in atherosklerotischen Plaques, erkennen Cholesterinkristalle mithilfe des NLRP3 Inflammasoms. Dieser Multiproteinkomplex des angeborenen Immunsystems verursacht die Ausschüttung der pro-inflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-1β und IL- 18, die entscheidend zur vaskulären Inflammation beitragen und damit für das Voranschreiten der Atherosklerose verantwortlich sind. Eine Reduktion der Cholesterinkristallmenge in atherosklerotischen Plaques könnte voraussichtlich die vaskuläre Inflammation und folglich das Voranschreiten der Atherosklerose verringern. <br /> In dieser Studie wurde im Mausmodell untersucht, ob 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (CD), welches Cholesterin in Lösung bringt und aus Zellen entfernen kann, auch die vaskuläre Ablagerung von Cholesterinkristallen reduziert oder diese aus den atherosklerotischen Plaques entfernen kann, und ob dadurch die Entwicklung und das Voranschreiten der murinen Atherosklerose verhindert wird. Tatsächlich beeinträchtigte die Behandlung mit CD die Entwicklung der Atherosklerose in Mäusen, was an einer Reduktion der Plaquegröße und der Cholesterinkristallmenge im Plaque erkennbar war. Zudem bewirkte die Behandlung mit CD sogar die Regression von bereits etablierten atherosklerotischen Plaques. Daraufhin wurden die molekularen Mechanismen des atheroprotektiven Effekts von CD <em>in vitro</em> in Makrophagen untersucht. Die Behandlung von Cholesterinkristall-beladenen Makrophagen mit CD führte zur Auflösung der intrazellulären Cholesterinkristalle und förderte die Esterifizierung und den Efflux des aus den Kristallen herausgelösten Cholesterins. Zudem wurde dieses Cholesterin vermehrt zu Oxysterinen, wie zum Beispiel 27-Hydroxycholesterin, metabolisiert. Einige Oxysterine fungieren als endogene Agonisten für LXR (<em>liver X receptor</em> ) Transkriptionsfaktoren, die wiederum Gene aktivieren, welche den Cholesterinefflux und antiinflammatorische Prozesse regulieren. Tatsächlich induzierte die Behandlung mit CD eine LXR-basierte transkriptionelle Umprogrammierung der Makrophagen auf erhöhten Cholesterinefflux. Damit einhergehend förderte CD in Abhängigkeit von LXR den reversen Cholesterintransport und die Ausscheidung von ursprünglich kristallinem Cholesterin aus Cholesterinkristall-beladenen Makrophagen. Darüber hinaus war die Aktivierung von LXR Transkriptionsfaktoren auch für die atheroprotektiven und anti-inflammatorischen Effekte von CD <em>in vivo</em> in muriner Atherosklerose erforderlich. <br /> Die vorliegende Studie zeigt eine atheroprotektive Wirkung von CD im Mausmodell, die mit der Auflösung und Beseitigung von Cholesterinkristallen aus atherosklerotischen Plaques einhergeht. Dabei spielt die erhöhte Produktion von Cholesterin-basierten endogenen LXR Agonisten, welche zur Aktivierung anti-atherogener Transkriptionsprozesse führen, eine entscheidende Rolle. Da eine Behandlung mit CD bereits von der FDA (<em>U.S. food and drug administration</em>) für die klinische Nutzung zugelassen ist, könnte CD unmittelbar in klinischen Studien zur Prävention und Behandlung von humaner Atherosklerose getestet werden.