Die Hydroxylierung von Ectoin und Derivaten durch die Hydroxylase EctD aus <em>Halomonas elongata</em>

Abstract

Kompatible Solute, von halophilen Mikroorganismen intrazellulär akkumulierte Substanzen zur Aufrechterhaltung des Turgors, sind in den letzten Jahren stark ins Interesse der biotechnologischen Forschung gerückt. Neben ihrer Funktion als osmoregulatorische Solute üben sie wichtige Schutzfunktionen für die Zelle sowie für Makromoleküle aus. Von besonderer Bedeutung dabei sind die zyklischen Aminosäurederivate Ectoin und Hydroxyectoin. Während für Ectoin bereits ein Verfahren zur großtechnischen Produktion etabliert ist, ist die Gewinnung des 5-Hydroxyderivats aus <i>H. elongata</i> mit einer anschließenden chromatographischen Aufreinigung verbunden, da der Organismus Hydroxyectoin zwar unter Hochsalzbedingungen und hohen Temperaturen produziert, allerdings immer in Verbindung mit Ectoin (Ectoin/Hydroxyectoin-Verhältnis von 1:1).<br /> Das Ziel der vorliegenden Arbeit lag in der Untersuchung der Hydroxylierung von Ectoin und Derivaten durch die Ectoinhydroxylase EctD aus <i>H. elongata</i>. In einem ersten Schritt wurde ein Produktionsstamm für Hydroxyectoin in <i>H. elongata</i> etabliert. Durch die Konstruktion der genomischen Mutanten <i>H. elongata</i> Maku03 Δ<i>ectB::ectD</i>, <i>H. elongata</i>Δ<i>ectB::ectD</i> und <i>H. elongata</i> Δ<i>ectB::ectD</i> Δ<i>promectD::promKB1</i> konnte das vom Wildtyp akkumulierte Ectoin/Hydroxyectoin-Verhältnis von 1:1 bereits bei niedrigeren Salinitäten und Temperaturen erzielt werden. Auch durch plasmidvermittelte Erhöhung des EctD-Gehalts in <i>H. elongata</i> pPromEct_ectD wurde dieses Verhältnis bei niedrigeren Temperaturen und Salinitäten erreicht, als es für den Wildtyp notwendig ist. Durch Anwendung eines zusätzlichen Temperaturschocks von 37 °C auf 50 °C wurde eine fast vollständige Umsetzung von Ectoin zu Hydroxyectoin beobachtet, so dass in Zukunft durch Umstellung des Produktionsverfahrens Hydroxyectoin mit einer viel höheren Ausbeute, als bislang erreicht, produziert werden kann.<br /> Neben der Optimierung eines Produktionsstamms für Hydroxyectoin in <i>H. elongata</i> wurde ein Ganzzellbiokatalyse-System in <i>Escherichia coli</i> zur stereospezifischen Hydroxylierung von Soluten etabliert. Durch Expression des <i>ectD</i>-Gens in <i>E. coli</i> BL21 pETectDHis wurde eine vollständige Hydroxylierung von bis zu 10 mM Ectoin erzielt. Glutamat stellte sich als optimale C-Quelle für die Hydroxylierungsreaktion heraus. Weiterhin wurde gezeigt, dass es sich bei der Ectoinhydroxylase EctD aus <i>H. elongata</i> um ein verhältnismäßig unspezifisches Enzym handelt, welches zyklische Verbindungen wie Prolin, die Ectoinderivate DHMICA und Homoectoin, ADPC sowie das inkompatible Solut Guanidino-Ectoin hydroxyliert. Mit einer hohen spezifischen Umsatzrate von 320 mg/g TG * h ermöglicht dieses System in Zukunft einen Einsatz in der Produktion dieser neuartigen hydroxylierten Verbindungen.