Niederkrüger, Holger: Expressionssysteme zur Untersuchung der Pederin- und Psymberin-Biosynthese aus nicht kultivierten bakteriellen Symbionten. - Bonn, 2011. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-24460
@phdthesis{handle:20.500.11811/4944,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-24460,
author = {{Holger Niederkrüger}},
title = {Expressionssysteme zur Untersuchung der Pederin- und Psymberin-Biosynthese aus nicht kultivierten bakteriellen Symbionten},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2011,
month = mar,

note = {Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Expression und Charakterisierung von Enzymen der Pederin- und Psymberin-Biosynthese sowie mit den Fortschritten in der heterologen Expression des Pederin-Genclusters. Pederin und Psymberin werden von bakteriellen Symbionten produziert. Der Pederin-Produzent hat eine Symbiose mit Käfern der Gattung Paederus und Paederidus ausgebildet, wogegen der Psymberin Produzent aus dem Schwamm Psammocinia aff. bulbosa stammt. Sowohl Pederin als auch Psymberin zeichnen sich durch eine sehr hohe antitumorale Wirksamkeit aus. Die Biosynthese wird über Typ I Polyketidsynthasen (PKS) realisiert, deren Acyltransferasen (AT) in trans agieren. Die PKS hat einen modularen Aufbau, wobei jedes Modul in einzelne Domänen untergliedert ist. In die Psymberin-PKS sind dabei eine während bei der Pederin-PKS zwei Nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS)-Module integriert. Im Zentrum dieser Arbeit steht die Expression, Reinigung und Charakterisierung verschiedener Enzyme der Psymberin- und Pederin-Biosynthese. Als Ziel dieser Experimente steht die enzymatische in vitro-Erforschung der Einführung von ß-Verzweigungen, a-Hydroxylierungen und ß-Methoxylierungen in Polyketide am Beispiel von Pederin und Psymberin. Diese ungewöhnlichen Biosyntheseschritte waren zu Beginn dieser Arbeit noch nicht näher charakterisiert und könnten Potential für die kombinatorische Polyketid-Biosynthese zur Generierung nicht natürlicher Polyketide besitzen. Ein weiteres sehr zentrales Thema stellt die Charakterisierung der trans-AT-katalysierten Acylierungsreaktion der Acylcarrierproteine (ACP) dar.
Auf Basis von Vorarbeiten, die aus der initialen Charakterisierung der AT PedD und ihrer Substratübertragungsreaktion auf die ACPs PedN und die Doppel-ACP von PedI3 bestanden, wurden diese Experimente erweitert und mit einem ganzen Modul (PedI3) des Pederin-Biosynthese-Gencluster sowie zwei einzelnen modularen ACPs (PsyA-ACP3 und PsyD-ACP1) des Psymberin-Clusters durchgeführt. Das Modul PedI3 konnte hierzu als His8-Fusionsprotein exprimiert und gereinigt werden. Zusätzlich wurde PedI3 fusioniert mit zwei Linkersequenzen der Erythromycin-PKS sowie einer Linkersequenz von PedF als His8-Linker-PedI3-Fusionsprotein exprimiert und gereinigt. Dabei erwies sich die Co-Expression von Chaperonen, durch die eine 6 bis 11 fach erhöhte Zielproteinkonzentration in den Elutionsfraktionen erzielt wurde, als sehr hilfreich. Ebenfalls als His8-Fusionsprotein konnten die ACPs PsyA-ACP3 und PsyD-ACP1 exprimiert und gereinigt werden. Eine Umwandlung der ACPs von der inaktiven apo- in die aktive holo-Form konnte durch die Co-Expression der Phosphopantetheinyltransferase (PPTase) Svp aus Streptomyces verticillus ATCC15003 durchgeführt werden. Der Nachweis der erfolgten Phosphopantetheinylierung wurde an PsyA-ACP3 mittels MALDI-TOF-TOF-MS und LC-MS nachgewiesen. Der Nachweis der Phosphopantetheinylierung von PedI3 und PsyD-ACP1 erfolgte indirekt über eine erfolgreiche Substratübertragung auf die putative holo-Form sowie fehlender Acylierung der vermeintlichen apo-Form. Bei dem Einsatz der Enzyme in Assays mit radioaktiv markierten Substraten zeigte sich, dass PedD in der Lage ist, Malonyl-CoA auf die holo-Form von PedI3 und dessen Linkerfusionsprodukten sowie auf PsyA-ACP3 und PsyD-ACP1 zu übertragen. Keine Übertragung erfolgt bei einem Einsatz von Acetyl-CoA und der Verwendung der jeweiligen apo-Form der ACPs. Diese Ergebnisse bestätigen die Substratspezifität und fehlende ACP-Spezifität von PedD und zeigen dies spezifischer, da die PedD-mediierte Substratbeladung an einem ganzen Modul getestet wurde. Um die Substratübertragungsreaktion von PedD kinetisch zu untersuchen, wurde die enzymatische Reaktion an einen bereits bekannten a-Ketoglutaratdehydrogenase Assay gekoppelt. Dabei konnten die kinetischen Daten bei 10 °C für die PedD-katalysierte Substratübertragung auf die ACPs PedN und PsyA-ACP1 sowie die Selbstacylierungsreaktion der ACPs ermittelt werden. Für die PedD-katalysierte Substratübertragung auf PedN ergab sich ein Wert für KM von 2,3 µM, für kcat von 0,045 s-1 sowie für kcat x KM -1 von 0,019 s -1 x µM -1. Die PedD-katalysierte Substratübertragung auf das ACP PsyA-ACP3 zeigte einen KM von 1,7 µM, einen kcat von 0,044 s-1 sowie einen kcat x KM -1 von 0,0257 s-1 x µM-1. Die Selbstacylierungsreaktion von PedN ergab für KM 54 µM, für kcat 0,005 s-1 sowie für kcat x KM -1 0,00009 s -1 x µM-1. Die Selbstacylierungsreaktion von PsyA-ACP3 wurde KM zu 131 µM, kcat zu 0,0059 s-1 sowie kcat x KM-1 zu 0,000045 s-1 x µM-1 ermittelt. Für die zweite AT PedC konnte bisher keine Substratübertragung auf die ACPs nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse stammen aus Studien mit einem Fusionsprotein aus Maltosebindeprotein und PedC. Um diese fehlende Aktivität zu bestätigen oder zu widerlegen, wurde PedC mit einem kurzen Strep Tag II Affinitäts-Tag fusioniert und unter Co-Expression von Chaperonen exprimiert und gereinigt. Der Einsatz von PedC in Assays mit radioaktiv markiertem Malonyl- und Acetyl-CoA zeigte, dass PedC auch als Fusion mit dem Strep Tag II nicht in der Lage ist, die Substrate zu akzeptieren. Insgesamt ist PedD somit für die Übertragung aller Elongationssubstrate (Malonyl-CoA) auf die ACPs während der Pederin-Biosynthese zuständig. Außerdem liefern die Experimente mit den ACPs PsyA-ACP3 und PsyD-ACP1 die ersten funktionellen Daten zum Psymberin-Cluster.
Zu Beginn dieser Arbeit war die Einführung von ß-Verzweigungen in Polyketide völlig unerforscht. Daher sollte am Beispiel der Einführung der Exomethylengruppe im Pederin diese enzymatischen Schritte näher beleuchtet werden. Hierzu wurden als zentraler Bestandteil das Modul PedI3 und dessen genannte Linkerfusionsprodukte exprimiert und aufgereinigt. Die Aktivität von PedI3 und dessen Linkerfusionsprodukte konnte aufgrund der Substratakzeptanz gegenüber Malonyl-CoA nachgewiesen werden. Weitere akzessorische Proteine, die bei der Biosynthese involviert sein sollten, sind das ACP PedN, die Ketosynthase (KS) PedM, das HMGCoA-Synthase-artige Protein (HMGS) PedP und die Crotonase (CR) PedL. Für PedN stand bereits ein funktionierendes Expressionssystem zur Verfügung. PedM und PedP waren bereits kloniert und konnten im Rahmen dieser Arbeit als His8-Fusionsproteine unter Co-Expression von Chaperonen exprimiert und gereinigt werden. PedL wurde neu kloniert und konnte als His8-Fusionsprotein sowie als StrepTag II-PedL-His10-Fusionsprotein exprimiert und gereinigt werden. Somit wurde durch die Expressionen die enzymatische Grundlage für die Assays gelegt. Allerdings zeigte sich in der massenspektrometrischen Analytik die Problematik, dass die Detektion von Intermediat-beladenen Proteinfragmenten mit den getesteten Methoden, unter anderem aufgrund von Chaperon-Verunreinigungen, nicht erfolgreich war. Die Chaperone konnten auch mit unterschiedlichsten Methoden nicht vom Zielprotein getrennt werden. Daher sind die Proteine für die Assays vorhanden, allerdings müssen in weiteren Arbeiten die analytischen Methoden sowie die Proteinreinigungsmethoden verbessert werden, um eine Analytik der Assays zu ermöglichen.
Kandidaten für die Einführung von a-Hydroxylierungen in Polyketide sind die Enzyme PsyC, eine putative Fe(II) a-Ketoglutarat-abhängige a-Hydroxylase, sowie PsyK, eine putative FAD-abhängige Oxidoreduktase. PsyC konnte als His8-Fusionsprotein unter Co-Expression von Chaperonen sowie, ohne Chaperon Co-Expressionen, als Fusion mit dem Sumo-Löslichkeits-Tag exprimiert und gereinigt werden. PsyK konnte ebenfalls als His8-Fusionsprotein sowie als N-terminales und C-terminales Strep-Tag II Protein exprimiert und isoliert werden. Durch ICP-OES Messungen konnte für die PsyC-Elutionsfraktionen nachgewiesen werden, dass PsyC spezifische Eisenkonzentrationen von 1,26 (± 0,59) mol x mol-1 für die His8-Fusionsproteine bzw. 1,93 (± 0,70) mol x mol-1 für die Fusionen mit dem Sumo-Löslichkeits-Tag vorhanden sind. Andere Elemente konnten als Co-Faktoren ausgeschlossen werden. Daher scheint sich die postulierte Funktion von PsyC als Fe(II) a-Ketoglutarat-abhängige a-Hydroxylase zu bestätigen. Zusätzlich konnte über ein Alignment mit anderen Fe(II) a-Ketoglutarat abhängigen a-Hydroxylasen das für diese Enzyme spezifische und konservierte Aminosäure-Motiv His1-X-Asp/Glu-Xn-His2 gefunden werden. Dies verstärkt die Annahme, dass PsyC für die a-Hydroxylierung zuständig ist. Der Einsatz von PsyC in Assays mit dem N-Acetylcysteamin (SNAC)-gekoppelten postulierten Substrat 33, dass in Anlehnung an das Intermediat von Modul 3 der Psymberin-Biosynthese synthetisiert wurde, zeigte jedoch keine Umsetzung zu 37.
Für den Nachweis der putativ methoxylierenden Funktion der PsyD O-MT Domäne konnte das Enzym als His8-Fusionsprotein sowie als N-terminales und C-terminales Strep Tag II Fusionsprotein exprimiert werden. Das His8-Fusionsprotein wurde in Enzymassays mit dem SNAC-Substrat 33 eingesetzt, jedoch konnte keine Umsetzung zu 41 nachgewiesen werden.
Die wahrscheinlichste Fehlerquelle bei den erfolgten a-Hydroxylierungsassays und O-Methylierungsassays liegt in der Verwendung des SNAC-Substrates 33, da es strukturell nicht identisch zum postulierten Substrat 35 bzw. 36 ist und aufgrund der einfacheren Synthese als vereinfachtes Testsubstrat eingesetzt wurde. Daher sollten die Assays in weiteren Experimenten unter Verwendung des postulierten Substrates 35 bzw. dessen CoA-Ester 36 nochmals wiederholt werden. Zur Analyse der Reaktionen an ACP-gebundenen Substraten konnten die ACPs PsyA-ACP3 und PsyD-ACP1 bereits erfolgreich exprimiert und isoliert werden.
Neben den Studien an heterolog exprimierten Enzymen der Psymberin- und Pederin-Biosynthese stellen Experimente zur heterologen Expression des kompletten Pederin-Clusters einen weiteren zentralen Punkt dieser Arbeit dar. Als Ausgangspunkt standen Acinetobacter baylyi ADP1 und Pseudomonas stutzeri JM300-Stämme zur Verfügung, die den Gencluster bereits enthielten. Transkriptionsanalysen zeigten eine fehlende Transkription von pedM, N und L. Daher wurden zur Komplementierung der Transkripte Plasmide konstruiert, die pedM, N und L unter der Regulation des pedC/pedD-Promotors enthalten. Folgende Transkriptionsanalysen zeigten die komplementierende Funktion von pedM, N und L der Plasmide, sodass auf Ebene der Transkription alle Gene des Pederin-Clusters transkribiert wurden. Allerdings konnte aus Kultivierungen der entsprechenden Stämme weder Pederin noch Biosynthese-Intermediate des Pederins detektiert werden. Theoretische Untersuchungen auf Basis des Codongebrauchs konnten mögliche Gründe für die fehlenden Metabolite aufdecken. Gravierende Unterschiede bezüglich der relativen Adaptivitäten von AGG und CGG (jeweils kodierend für Arg) zeigten sich bei Acinetobacter baylyi ADP1 bei einem Vergleich mit dem Pederin-Cluster. Auch bei Pseudomonas sp. konnte ein moderater Unterschied bezüglich der relativen Adaptivitäten für die Codons AGA und AGG (Arg), ATA (Ile) sowie CTA, CTT und TTA (kodierend für Leu) festgestellt werden. Daher könnte eine Ursache für die fehlende Metabolitproduktion in der Translation zu finden sein.},

url = {https://hdl.handle.net/20.500.11811/4944}
}

The following license files are associated with this item:

InCopyright