Weiterentwicklung der Intramertechnologie zur Charakterisierung von Cytohesin-2 als neuen Effektor der MAP-Kaskade in HeLa-Zellen

Abstract

Die Proteine der Klasse der kleinen Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEF) katalysieren den Austausch von GDP gegen GTP an monomeren G-Proteinen der ARF-Familie und sind an der Regulation des Vesikeltransports beteiligt. Darüber hinaus übernehmen diese eine wichtige Rolle in einer Reihe unterschiedlicher zellulärer Prozesse wie der Reorganisation des Actincytoskeletts, der T-Zelladhäsion und der Zelldifferenzierung. Die Steuerung dieser Prozesse erfolgt u. a. durch die Interaktion von kleinen GEF mit α_Lβ₂-Integrin. Darüber hinaus sind funktionale Wechselwirkungen mit anderen Proteinen bekannt, die allerdings nur unvollständig charakterisiert sind. <br /> Der Klasse der kleinen GEF werden vier Proteine zugeordnet, die als Cytohesin 1-4 bezeichnet werden. Diese weisen sowohl strukturell als auch funktionell eine große Homologie zueinander auf. Die zentrale Stellung und Komplexität der durch kleine Austauschfaktoren regulierten Prozesse unterstreicht die Bedeutung einer weiteren Charakterisierung und hebt die Notwendigkeit der Entwicklung neuer Werkzeuge zur biologischen Funktionsaufklärung hervor.<br /> In der vorliegenden Arbeit wurde ein RNA-Aptamer entwickelt, welches den Austauschfaktor Cytohesin-2 bindet und gegenüber Cytohesin-1 diskriminiert. Dieses durch <em>in vitro</em> Selektionstechnik erhaltene Aptamer bindet sein Zielprotein unter Beteiligung der Coiled-coil Domäne ohne dabei die Aktivität der Sec7- oder der PH-Domäne zu modulieren. <br /> Die Verwendung von Aptameren in Zellen (Intramere) ist bisher an den Einsatz eines Expressionssystems geknüpft. Diese Einschränkung konnte überwunden werden. So wurde das Anti-Cytohesin-2 Aptamer durch Lipofektion in HeLa-Zellen eingebracht. Eine zusätzliche Modifizierung oder Stabilisierung war nicht notwendig. Auf die zelluläre Transkriptionsmaschinerie oder die Verwendung eines Expressionssystems konnte verzichtet werden. <br /> Die funktionelle Charakterisierung von Cytohesin-2 mittels des spezifischen Intramers führte zur Aufklärung einer bis dato unbekannten Funktion als positiven Effektor der MAP-Kinasen Erk1/-2. So konnte die serumabhängige Expression von Genen unter der Kontrolle des „<em>serum response elements</em>“ (SRE) durch Inhibition von Cytohesin-2 blockiert werden. Das Bindungsepitop des Intramers legt dabei eine Beteiligung der Coiled-coil-Domäne von Cytohesin-2 an dieser Signaltransduktion nah. <br /> Durch Überexpression einer Sec7-defizienten Mutante von Cytohesin-2 konnte eine Beteiligung der Sec7-Domäne an der Modulation der MAP-Kinase Aktivität nachgewiesen werden. Eine regulatorische Funktion der Coiled-coil-Domäne bezüglich der Sec7-Aktivität erscheint somit als wahrscheinlich. <br /> Durch Verwendung von siRNA-Strategien, die entweder gegen Cytohesin-2 oder Cytohesin-1 gerichtet waren, konnte eine Beteiligung von Cytohesin-1 an der Regulation der Erk1/-2-Aktivität ausgeschlossen werden und unterstreicht zusätzlich die bereits durch das Intramer erzielten Resultate. <br /> Intramertechnologie als Werkzeug zur biologischen Funktionsaufklärung von Proteinen im Kontext einer lebenden Zelle weist ein hohes Potential auf und wird wohl in Zukunft eine größere Verbreitung in vielen Bereichen der Proteomforschung finden.