Allosterische Modulation an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren des Subtyps M₂

Abstract

Muskarinische Acetylcholinrezeptoren gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und besitzen neben der orthosterischen Bindungsstelle für konventionelle Liganden wie Acetylcholin oder <i>N</i>-Methylscopolamin eine zweite, allosterische Bindungsstelle. Über diese können Muskarinrezeptoren aller fünf Subtypen allosterisch moduliert werden. Einen Prototyp-Modulator stellt die Alkan-bisammonium-Verbindung W84 [N,N'-Bis[3-(1,3-dihydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)propyl]-N,N,N',N'-tetramethyl-1,6-hexan-diammoniumdibromid] dar. Vorangegangene Untersuchungen ergaben, dass die Affinität von W84 zu Muskarinrezeptoren durch strukturelle Abwandlung dieser Verbindung deutlich gesteigert werden kann. Es gelang jedoch nicht, den hemmenden Einfluss von W84 auf die Bindung eines orthosterischen Liganden (negative Kooperativität) in eine allosterische Bindungsförderung (positive Kooperativität) zu überführen. <br /> In der vorliegenden Arbeit wurden neue Alkan-bisammonium-Verbindungen mit bisher nicht vorhandenen Strukturmodifikationen hinsichtlich ihres Potentials zur allosterischen Förderung der Ligandbindung an Muskarinrezeptoren untersucht. Die ausgewählten allosterischen Testsubstanzen wiesen eine Phthalimidopropyl-substituierte Hexan-bisammonium-Struktur auf, die durch symmetrische bzw. unsymmetrische Methylierung des Phthalimidringes und/ oder der Propylseitenkette variiert wurde. Es wurden Radioligandbindungsexperimente mit dem orthosterischen Liganden [³H]<i>N</i>-Methylscopolamin ([³H]NMS) an M₂-Rezeptoren in Membransuspensionen aus Herzventrikelgewebe vom Hausschwein durchgeführt (Mg,Tris,Cl,P_i-Puffer: 3,6 mM MgHPO₄ x 3 H₂O, 50 mM Tris-HCl; pH 7,3; 37°C). In kinetischen Experimenten (Dissoziationsexperimente) wurde die allosterische Verzögerung der Dissoziation von [³H]NMS-Rezeptor-Komplexen untersucht. Der in diesen Experimenten ermittelte pEC_0,5,diss-Wert diente als Maß für die Affinität des allosterischen Modulators zum Orthoster-besetzten Muskarinrezeptor. In Gleichgewichtsbindungsexperimenten wurden die Kenngröße pK_A, die die Affinität des Modulators zum freien Rezeptor beschreibt, sowie der Kooperativitätsfaktor α der allosterischen Interaktion zwischen dem Modulator und dem orthosterischen Liganden [³H]NMS bestimmt. Aus diesen Experimenten wurde ferner die Kenngröße p(α K_A)</nobr> abgeleitet, die als Maß für die Affinität zum Orthoster-besetzten Rezeptor gilt. <br /> Erste orientierende Untersuchungen zeigten, dass einige methylierte Alkan-bisammonium-Verbindungen die Fähigkeit besitzen, die Gleichgewichtsbindung von [³H]NMS zu erhöhen. Ausgewählte, in den Positionen der Phthalimidgruppe und/ oder der Propylseitenkette systematisch unterschiedlich methylierte W84-Derivate wurden zur näheren Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen herangezogen. <br /> Es konnte gezeigt werden, dass positive Kooperativität zwischen den Modulatoren und [³H]NMS mit einer bevorzugten Steigerung der Affinität der Modulatoren zum Orthoster-besetzten M₂-Rezeptor gegenüber einer schwächer ausgeprägten Zunahme der Affinität zum freien M₂-Rezeptor einhergeht. Die Optimierung der Affinitäten der allosterischen Modulatoren zugunsten der Affinität zum Orthoster-besetzten M₂-Rezeptor hängt dabei streng von der Position der Methylierung der betreffenden Verbindung ab. Die negative Kooperativität der nicht methylierten Ausgangsverbindung W84 mit [³H]NMS kann durch kombinierte Phthalimidring- und Seitenketten-Methylierung in nur einer Molekülhälfte des Modulators in positive Kooperativität umgewandelt werden. Eine unabdingbare Voraussetzung für positive Kooperativität scheint die Seitenketten-Methylierung zu sein, denn die alleinige Phthalimidring-Methylierung erhöht zwar die Affinität, lässt aber die negative Kooperativität unverändert. Eine zusätzliche Methylierung der anderen Molekülhälfte besitzt hinsichtlich der allosterischen Förderung der [³H]NMS-Gleichgewichtsbindung keinen zusätzlichen Effekt. Die Methylierung der anderen Molekülhälfte erhöht allerdings das Affinitätsniveau der Interaktion mit dem M₂-Rezeptor. <br /> Als nächstes sollte die Frage geklärt werden, ob die mit [³H]NMS positiv bzw. neutral kooperativen methylierten Alkan-bisammonium-Verbindungen eine gegenüber dem negativ kooperativen Prototyp-Modulator W84 veränderte Abhängigkeit von essentiellen Rezeptorepitopen aufweisen. Diese Untersuchungen wurden an transient in COS 7-Zellen exprimierten humanen Wildtyp- bzw. mutierten Muskarinrezeptoren durchgeführt (Na,K,P_i-Puffer: 4 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄; pH 7,4; 23°C). Der in einer Molekülhälfte Phthalimidring- und Seitenketten-methylierte allosterische Modulator, der in Experimenten an suinen M₂-Rezeptoren in Mg,Tris,Cl,P_i-Puffer sowie in Na,K,P_i-Puffer positive Kooperativität mit [³H]NMS gezeigt hatte, erwies sich an den humanen M₂-Rezeptoren in Na,K,P_i-Puffer als annähernd neutral kooperativ mit diesem orthosterischen Liganden. Das Kooperativitätsverhalten des methylierten Modulators war dementsprechend von der in beiden Puffersystemen beobachteten negativen Kooperativität zwischen dem Prototyp-Modulator W84 und [³H]NMS verschieden. In Dissoziationsexperimenten mit [³H]NMS an M₂/M₅-chimären sowie punktmutierten Muskarinrezeptoren konnte die Aminosäure M₂¹⁷⁷Tyrosin als das zweite (neben der aus vorangegangenen Untersuchungen bereits bekannten Aminosäure M₂⁴²³Threonin) für die M₂/M₅-Selektivität der untersuchten Modulatoren essentielle Epitop identifiziert werden. Diese beiden Aminosäuren tragen alleine die M₂/M₅-Selektivität am Orthoster-besetzten Rezeptor sowohl der methylierten Verbindung als auch der Muttersubstanz W84. <br /> Nachfolgende Gleichgewichtsbindungsexperimente zeigten, dass die am M₂-Wildtyp-Rezeptor beobachtete annähernd neutrale Kooperativität des methylierten allosterischen Modulators mit [³H]NMS durch Austausch des Aminosäure-Paares M₂¹⁷⁷Tyrosin und M₂⁴²³Threonin gegen die korrespondierenden M₅-Aminosäuren in negative Kooperativität umgewandelt wird. Dieser Befund verdeutlicht, dass dieses Aminosäure-Paar einen Einfluss auf die M₂/M₅-Selektivität der Kooperativität des methylierten Modulators mit [³H]NMS besitzt. <br /> In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass allosterische Modulatoren vom Alkan-bisammonium-Typ die Gleichgewichtsbindung eines orthosterischen Liganden am muskarinischen M₂-Rezeptor zu fördern vermögen, wenn sie das Strukturelement der Seitenketten-Methylierung enthalten. Diese Strukturvariation verändert jedoch nicht die Abhängigkeit von den beiden essentiellen Rezeptorepitopen, M₂¹⁷⁷Tyrosin und M₂⁴²³Threonin. Aus der Interaktion mit diesen Epitopen kann anscheinend ein solcher Affinitätsgewinn gezogen werden, dass negative in positive Kooperativität übergeht.