MicroRNAs in the bovine ovary and placentas derived from in vivo, in vitro and nuclear transfer pregnancies

Abstract

MicroRNAs are the major class of gene regulating molecules playing pivotal roles at post-transcriptional level. Identification and expression profiling are the initial steps to understand their regulation of biological processes. Despite increasing efforts in miRNAs characterization in different species, little is known in the bovine reproductive tissues especially in ovary and placenta. Two subsequent studies were carried out to the expression of miRNAs in bovine ovary and Day-50 placenta derived from different sources of pregnancy. The first study aims to identify and characterize miRNAs in bovine ovary through cloning, expression analysis and target prediction. The constructed miRNA library revealed cloning of 50 known and 24 novel miRNAs. Among these, 38 were new miRNAs which were derived from 43 distinct loci with characteristic secondary structure. Most of the miRNAs were cloned multiple times and thereby reflecting their expression level and potential role in the ovary. Analysis of identified miRNAs in different intra-ovarian structures and other tissues reveals their stage and tissue specific expression patterns. Furthermore, in silico target prediction and Gene Ontology analysis of the targets genes identified several biological processes and pathways underlying the ovarian function. Results of this study suggest the presence of miRNAs in the bovine ovary; thereby elucidate their potential role in regulating diverse mechanisms underlying the ovarian functionality. <br /> The second study aimed to elucidate the difference in expression profile of miRNAs in the placenta at day 50 derived from Somatic cell nuclear transfer (SCNT), in vitro production (IVP) and artificial insemination (AI) pregnancies by quantifying 377 miRNAs. The study reveals a massive deregulation of miRNAs which were poorly reprogrammed and affected as large chromosomal cluster as well as miRNA families in the NT and IVP placenta compared to that of AI. Furthermore, cell specific localization miRNAs in the expanded blastocysts and expression profiling in different developmental stages of embryos and placenta identified that the major deregulation of miRNAs arises at day 50 of NT and IVP pregnancies. This deregulation were found to be less dependent on global DNA methylation, rather aberrant miRNA processing molecules were evidenced. Among them, observed down regulation of AGO2 could be a reason for global down regulation of miRNAs in the NT or IVP placenta. Identified deregulation of miRNAs might associate to the abnormal placentogenesis in NT or IVP pregnancies, which are the results of aberrant genetic and epigenetic modification. Result of this study will help to move one step closer towards improving the efficiency of nuclear transfer pregnancy. <br /> Altogether, the present study has discovered miRNAs in the bovine ovary and elucidated the pattern of expression of miRNAs along with their regulatory mechanism in the placenta derived from pregnancies of various origins.

<strong>Untersuchung von MicroRNAs in bovinen Ovarien und Plazenten aus geklonten, in vivo und in vitro erzeugten Trächtigkeiten</strong><br /> MicroRNAs gehören zur großen Klasse der genregulierenden Moleküle und spielen eine bedeutende Rolle auf der posttranskriptionellen Ebene. Die Identifikation und die Erstellung von Expressionsprofilen sind die ersten Schritte für ein besseres Verständnis der miRNA und ihrer Beteiligung an der Regulierung von biologischen Prozessen. Trotz der zunehmenden Charakterisierung der miRNA in verschiedenen Spezies, sind kaum Untersuchungen in bovinen Ovarien und Plazenten bekannt. In zwei Studien wurde die miRNA Expression in bovinen Ovarien und in Plazenten am Tag 50 der Trächtigkeit, in unterschiedlich erzeugten Schwangerschaften untersucht. Das Ziel der ersten Studie war die Identifizierung und Charakterisierung von miRNAs in klonierten bovinen Ovarien, Expressionsanalysen sowie Target-Vorhersagen. Die konstruierte miRNA-Bibliothek ergab 50 bekannte und 24 neue miRNAs. Unter diesen waren 38 neue bovine miRNAs die von 43 eindeutigen Loci abgeleitet werden konnten, die eine charakteristische sekundäre Struktur zeigten. Durch die mehrfache Klonierung der meisten miRNAs, konnte ihr Expressionsniveau in den Ovarien erfasst werden. Analysen von miRNAs in unterschiedlichen intra-ovariellen Strukturen sowie anderen Geweben zeigten ihr phasen- und gewebsspezifisches Expressionsmuster. Des Weiteren konnte durch bioinformatische Auswertungen und Gen Ontology Analysen der Target Gene verschiedene biologische Prozesse und Pathways der Ovarienfunktion identifiziert werden. Die Ergebnisse dieser Studie deuten auf das Vorhandensein von miRNAs in bovinen Ovarien hin und verdeutlichen die potenzielle Bedeutung in der Regulierung diverser Mechanismen der Ovarienfunktion. Die zweite Studie sollte die Unterschiede von Expressionsprofilen von miRNAs in Plazenten am Tag 50 der Trächtigkeit von SCNT, IVP und AI Schwangerschaften durch Quantifizierung von 377 miRNAs aufklären. Die Studie zeigte eine starke reduzierte Expression und eine geringe Reprogrammierung der miRNAs in NT und IVP im Vergleich zu AI. Diese miRNAs gehören vermutlich zu einer miRNA Familie in einem chromosomalen Cluster. Des Weiteren zeigten zellspezifische Lokalisationen von miRNAs in der expandierenden Blastozyste und Expressionsprofile von unterschiedlichen Entwicklungsstadien im Embryo und in der Plazenta, dass die wichtigsten Deregulierungen von miRNAs am Tag 50 der Trächtigkeit in NT und IVP entstehen. Diese Deregulierung erwies sich als weniger abhängig von einer globalen DNA-Methylierung, vielmehr wurde eine Abweichung in den miRNA-Prozessgenen belegt. Von diesen könnte die reduzierte Expression von AGO2 die Ursache für die globale Deregulierung der miRNAs in NT oder IVP Plazenten sein. Die identifizierten Deregulationen der miRNAs könnten im Zusammenhang mit abnormaler Plazentogenese in NT oder IVP Trächtigkeiten stehen. Die Ursachen für Abnormalitäten in der Plazentogenese liegen in genetischen und epigenetischen Modifikationen. <br /> Zusammenfassend konnte durch diese Studien miRNAs in bovinen Ovarien identifiziert werden und Expressionsmustern der miRNAs sowie ihre regulierenden Mechanismen in der Plazenta von unterschiedlichen Trächtigkeiten beschrieben werden.