Bispidin-Derivate als neue nicotinische Acetylcholinrezeptor-Liganden

Abstract

Nicotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChR) sind ligandgesteuerte Ionenkänale, die sich aus fünf Untereinheiten zusammensetzen. Durch die Kombination verschiedener Untereinheiten (α1-α10, β1-β4, γ, δ ε) entstehen zahlreiche Subtypen (z. B. α4/β2*, α3/β4*, α7* oder der muskuläre Subtyp), die unterschiedliche Verteilung und Funktionen im zentralen und im peripheren Nervensystem sowie in einigen nicht-neuronalen Zelltypen besitzen. Sie sind an zahlreichen komplexen physiologischen Prozessen beteiligt, wie z. B. kognitiven Vorgängen, Bewegungsabläufen und der Schmerzwahrnehmung. Funktionsstörungen der nAChR werden eindeutig mit neurodegenerativen Erkrankungen, der Nicotinabhängigkeit, Entzündungen und Krebs in Verbindung gebracht. Daher sind nAChR zu interessanten Targets für die Arzneistoffforschung geworden.<br /> Das im 19. Jahrhundert entdeckte Cytisin ist zu einer sehr wichtigen Leitstruktur für die Entwicklung von bioaktiven Verbindungen geworden. Im Cytisinmolekül liegt eine mit einem 2-Pyridonring verbundene Bispidinteilstruktur vor, die als Ausgangsverbindung für die Synthese von Liganden für verschiedene biologische Targets untersucht wurde, u. a. für den nAChR. Diese Teilstruktur ist durch eine zweifache Mannich-Reaktion aus N-<em>t</em>Boc-4-piperidon, Formaldehyd und Benzylamin mit anschließender Reduktion der Carbonylgruppe synthetisch zugänglich, wobei man N-Benzyl-N’-<em>t</em>Boc-bispidin als Zwischenprodukt erhält. Einfach geschütztes Bispidin, im Besonderen N-<em>t</em>Boc-Bispidin, diente, nach der Abspaltung der Benzylschutzgruppe, als Ausgangsverbindung für die Synthese von verschiedenen Bispidin-Derivaten. Durch die Abspaltung der <em>t</em>Boc-Schutzgruppe und die Fällung als Fumarat konnten neue Bispidin-Derivate in einer fünf- bis sechsstufigen Synthese in hohen Ausbeuten und Reinheiten hergestellt werden.<br /> Die erhaltenen Bispidinamide, -sulfonamide und Harnstoffderivate wurden in Radioligand-Bindungsstudien (Kompetitionsexperimente) auf ihre Affinität zu verschiedenen nAChR Subtypen getestet, wobei [³H]Epibatidin (α4/β2*, α3/β4*, muskulärer Subtyp) und [3H]Methyllycaconitin (α7*) als Radioliganden und Membranpräparationen aus nativem Gewebe (Rattenhirn, Kalbs- oder Schweinenebenniere und Torpedo californica electroplax) verwendet wurde. N-<em>t</em>Boc-Bispidin interagierte ebenfalls mit dem nAChR (z. B. Ki = 45 nM für α4/β2*). Das einfachste Amidanalog des Bispidins, Acetylbispidin, zeigte hohe Affinität für α4/β2* (Ki = 5.6 nM). Weitere Verbindungen dieser Klasse zeigten ein sehr breites Affinitätsspektrum (z. B. Ki-Werte von 1.2 nM bis > 10,000 nM für α4/β2*), wodurch wichtige Hinweise für Struktur-Wirkungsbeziehungen gewonnen wurden. Der bioisostere Austausch der Amidgruppe gegen eine Sulfonamidgruppe führte zu einer geringeren oder zu einem Verlust der Affinität, z. B. Mesylbispidin mit einem Ki-Wert von > 5,000 nM für α4/β2*.<br /> In einem Teilprojekt wurden drei bekannte Cytisinderivate in größeren Mengen und hoher Reinheit für funktionelle Untersuchungen (patch-clamp Technik) und Tierversuche zu antidepressivem Verhalten bei Mäusen zur Verfügung gestellt. Sowohl die Extraktion des (-)-Cytisins aus den Samen des Goldregenbaumes (Laburnum anagyroides) als auch die anschließende vierstufige Synthese, die die Verwendung von Schutzgruppen, eine Bromierungsreaktion und eine palladiumkatalysierte Kreuzkupplungsreaktion (Suzuki-Miyaura) in einem Mikrowellenreaktor beinhaltete, konnten im Hinblick auf eine effizientere Reaktionsführung verbessert werden. 3-(Pyridin-3-yl)-Cytisin zeigte dabei eine schwache, partialagonistische Wirksamkeit am α4/β2* Subtyp, eine nur geringe Aktivierung anderer nAChR Subtypen und stärkere antidepressive Effekte in Mausmodellen zu antidepressivem Verhalten als Cytisin und kann deshalb als neue Leitstruktur für die Entwicklung von neuartigen Antidepressiva angesehen werden.

<strong>Bispidine Derivatives as Novel Ligands for the Nicotinic Acetylcholine Receptors : Synthesis, In vitro Pharmacology and Structure-Activity Relationships</strong><br /> Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are ligand-gated ion channels which are composed of five subunits. The combination of different subunits (α1-α10, β1-β4, γ, δ ε) lead to several subtypes (e.g. α4/β2*, α3/β4*, α7*, muscular subtype) which have various distribution and functions in the central and the peripheral nervous system as well as in some non-neuronal cell types. They participate in many complex physiological processes, e.g. cognitive function, motor processes or pain perception. Dysfunction of nAChRs are unequivocally related to neurodegenerative diseases, tobacco dependence, inflammation or cancer. Thus, the nAChRs have been shown to be interesting targets for drug development. <br /> Cytisine discovered in the 19th century is an invaluable template in the development of bioactive compounds. Particularly its bispidine framework which is fused to a 2-pyridone moiety has been used as a core structure for the synthesis of ligands for numerous biological targets including nAChRs. It is accessible by a double Mannich reaction from N-<em>t</em>Boc-4-piperidone, formaldehyde and benzylamine and subsequent reduction of the carbonyl group yielding N-benzyl-N’-<em>t</em>Boc-bispidine. The N-protected bispidine, especially N-<em>t</em>Boc-bispidine after cleavage of the N-benzyl protecting group, served as starting material for the synthesis of diverse bispidine analogs. New Bispidine derivatives could be obtained in five to six steps with high chemical yields and purities after the cleavage of the <em>t</em>Boc protective group and the precipitation as a fumaric acid salt.<br /> The obtained bispidine amides, sulfonamides and urea derivatives were tested for their affinities for different nAChR subtypes by competition assays with [³H]epibatidine (α74/β2*, α3/β4*, muscle type) and [3H]methyllycaconitine (α7*), respectively, using membrane fractions of native tissues (rat brain, calf/pig adrenals and Torpedo californica electroplax). N-<em>t</em>Boc-bispidine itself interacts with nAChRs, e.g. Ki: 45 nM for α4/β2*. The simplest amide analog, acetyl bispidine, displayed high affinity for α4/β2* (Ki: 5.6 nM), whereas other amide analogs showed a broad affinity spectrum, e.g. Ki values from 1.2 nM to > 10,000 nM for α4/β2*, which provided important insight into structure-affinity relationships. Bioisosteric replacement of the amide group for a sulfonamide group yielded less active or inactive compounds, e.g. mesyl bispidine with a Ki value > 5,000 nM for α4/β2*.<br /> In an additional project, three known cytisine derivatives have been synthesized in higher amounts and with high chemical purity and made available for further functional studies (patch clamp technique) and studies in animal models for antidepressant-like effects in mice. The extraction of (-)-cytisine from seeds of the golden rain tree (Laburnum anagyroides) as well as the subsequent four step synthesis, which included the use of a protective group (<em>t</em>Boc), a bromination and a palladium-catalysed cross-coupling reaction (Suzuki-Miyaura) in a microwave reactor, could be improved with regard to a greater synthetic efficiency. 3-(Pyridin-3’-yl)-cytisine displayed weak effects as a partial agonist for the α4/β2* subtype, only a small activation to other nAChR subtypes and stronger antidepressant-like effects in mice compared to cytisine. Thus, 3-(Pyridine-3’-yl)-cytisine can be seen as a new lead structure for the development of drugs to treat mood disorders.