Identifizierung und Charakterisierung neuartiger membranständiger Pyrimidin-Rezeptoren

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden drei Teil-Projekte bearbeitet, wobei es um die Fragestellung ging, ob neben den bekannten Adenosin- und Adenin-Rezeptoren auch Uridin- oder Uracil-Rezeptoren existieren. In der Literatur werden für die Pyrimidine Uridin und Uracil verschiedene pharmakologische Wirkungen (u.a. ZNS-depressive Wirkung) beschrieben, wobei der jeweilige Wirkmechanismus bis dato weitgehend ungekärt ist.Für Uridin wurde bereits von der Arbeitsgruppe Kimura et al. ein Uridin-Rezeptor postuliert, während für Uracil in der Literatur noch keine Untersuchungen darüber existieren. Die drei Teil-Projekte führten im Wesentlichen zu der Erkenntnis, dass sowohl für die Nukleobase Uracil als auch für das Nukleosid Uridin spezifische, hochaffine membranständige Bindungsstellen existieren. Die Charakterisierung der hiermit erstmals beschriebenen Uracil-Bindungsstelle bildete dabei den Schwerpunkt der Arbeit.<br /><b>Im ersten Teil-Projekt</b> wurde die Nukleobase Uracil näher untersucht. In Radioligand-Bindungsstudien mit [³H]Uracil wurden in verschiedenen Membranpräparationen spezifische Bindungsstellen identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass Uracil-bindende Proteine sowohl in nativen Kalbshirn-Geweben als auch in nativen Hirn-Geweben der Ratte und des Menschen in hoher Dichte exprimiert werden. In Kinetikexperimenten an Kalbshirn-Striatum-Membranpräparationen konnte nachgewiesen werden, dass die [³H]Uracil-Bindung reversibel ist, wobei eine sehr langsame Assoziation (t_1/2 = 72 Minuten; 5 nM, 37°C) und eine noch langsamere Dissoziation beobachtet werden konnte. Nach Etablierung eines Bindungsassays mit [³H]Uracil als Radioligand wurden in Kompetitionsexperimenten an Kalbshirn-Striatum-Membranpräparationen an­hand von 45 größtenteils monosubstituierten Uracil-Derivaten und 44 weiteren, zumeist strukturell verwandten Verbindungen die Struktur-Wirkungsbeziehungen untersucht. Die Uracil-Bindungsstelle läßt - insbesondere an den Positionen 1, 2, 3, 4 und 6 - nur geringe strukturelle Modifikationen des Uracil-Grundgerüstes zu. Lediglich die Position 5 scheint für eine Substitution geeignet zu sein. Gößere Substituenten führen allerdings auch hier zu einer drastischen Affinitätsabnahme oder sogar zu einem gänzlichem Affinitätsverlust. Zur Untersuchung der Funktionalität wurden Experimente zur Bestimmung der cAMP-Akkumulation, [³⁵S]GTPgS-Bindungsstudien, sowie Experimente zur Bestimmung der intrazellulären Calcium-Konzentration durchgeführt. Die Ergebnisse der cAMP-Versuche deuten darauf hin, dass Uracil zu einer Inhibierung der Adenylatcyclase in NG108-15-Zellmembranpräparationen führt (EC₅₀ = 24,2 nM), dass die Uracil-Bindungsstelle also eventuell mit einem G_i-Protein gekoppelt sein könnte. In [³⁵S]GTPgS-Bindungsstudien konnte allerdings keine Modulierung des G-Proteins beobachtet werden. Uracil führte in Calcium-Assays zu keinem Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration.<br /><b>In einem weiteren Teil-Projekt</b> wurde untersucht, ob die von der Arbeitsgruppe Kimura et al. postulierten Uridin-Rezeptoren tatsächlich existieren. Hierzu wurden Bindungsstudien mit [³H]Phen­acyluridin und [³H]Uridin durchgeführt. Dabei konnte für [³H]Uridin eine spezifische Bindung nachgewiesen werden, Bindungsstudien mit [³H]Phenacyluridin (1-15 nM) dagegen führten zu keiner spezifischen Bindung.<br /><b>Ein drittes Teil-Projekt</b> befasste sich mit dem Enzym Uridin-Cytidin-Kinase, dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym im Pyrimidin-Salvage-Stoffwechselweg. Dieses Enzym wurde aus Kalbs-Thymus isoliert und mittels säulenchromatographischer Verfahren aufgereinigt. Zur Charakterisierung des Enzyms wurde ein neuer Radioassay etabliert und zur Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante herangezogen. Die aufgereinigte Uridin-Cytidin-Kinase kann als wichtige und interessante Zielstruktur in zukünftigen Experimenten zur Identifizierung von neuen Inhibitoren und Substraten verwendet werden und eignet sich darüberhinaus zur quantitativen, biochemischen „Entfernung“ von Uridin. Dieses Pyrimidin-Derivat ist in Membranpräparationen enthalten und wird durch Zentrifugation möglicherweise nur teilweise entfernt. Da physiologisches Uridin pharmakologische Studien (Radioligandbindungsstudien, funktionelle Assays) stören kann, ist der Einsatz dieses Enzyms in Kombination mit enzymatisch stabilen Uridin-Analogen als Liganden von großer Bedeutung.