Pharmakologische und Biochemische Untersuchungen zur Allosterischen Modulation Agonist-induzierter Wirkungen an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren

Abstract

Muskarinische Acetylcholinrezeptoren verfügen über (mindestens) zwei Ligandbindungsstellen; die orthosterische Acetylcholinbindungstasche und die weiter extrazellulär lokalisierte allosterische Bindungsdomäne. Seit längerem ist bekannt, dass es möglich ist, durch allosterische Modulatoren orthosterische Liganden in ihrer Affinität zu muskarinischen Rezeptoren zu beeinflussen. Hinweise auf eine Beeinflussung der intrinsischen Aktivität muskarinischer Agonisten auf allosterischem Weg konnten erstmals von Zahn (Dissertationsschrift, Math.-Nat. Fakultät, Bonn, 1999) im Rahmen von Organbadversuchen am schlagenden Meerschweinchenherzvorhof vorgelegt werden. Es zeigte sich, dass Alcuronium offenbar allosterisch die intrinsische Aktivität des Partialagonisten Pilocarpin verringerte, dessen Affinität aber nicht beeinflußte. Beim Vollagonisten Oxotremorin M hingegen verminderte Alcuronium formal kompetitiv dessen Affinität, wohingegen die intrinsische Aktivität dieses Agonisten unverändert blieb. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Hinweise auf eine allosterische Beeinflussung der intrinsischen Aktivität auf zellulärer Ebene verifiziert werden können.<br /> Dazu wurde ein Meßsystem für den M₂-Acetylcholinrezeptor etabliert, das auf radioaktiver Basis die Aktivierung von G-Proteinen mit dem Radioliganden [³⁵S]GTPγS misst. Dazu wurden humane M₂-Rezeptoren in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) exprimiert und M₂-Rezeptorhaltige Membransuspensionen hergestellt.<br /> Anschließend wurden Radioligandbindungsexperimente durchgeführt, um die Affinität der einzelnen Liganden zu quantifizieren. Untersucht wurde dazu die Interaktion von Alcuronium und Pilocarpin bzw. Alcuronium und Oxotremorin M. Es wurde festgestellt, dass Alcuronium die intrinsische Aktivität von Pilocarpin mindert, aber nicht dessen Affinität. Im Gegensatz dazu mindert Alcuronium die Affinität von Oxotremorin M, aber nicht dessen intrinsische Aktivität. Alcuronium inhohen Konzentrationen war in der Lage, den agonistischen Effekt des Pilocarpins in einen antagonistischen umzuwandeln.<br /> Somit konnte erstmals im biochemisch-pharmakologischen Versuchsansatz die allosterische Hemmbarkeit einer Agonist-induzierten, M₂-Rezeptor vermittelten G-Protein-Aktivierung gezeigt werden.