Amino acid N-acyltransferases in Human Metabolism

Abstract

The human enzymes GLYAT (glycine N-acyltransferase), GLYATL1 (glutamine N-phenylacetyltransferase) and GLYATL2 (glycine N-acyltransferase-like protein 2) are not only important in the detoxification of xenobiotics via the human liver, but are also involved in the elimination of acyl residues that accumulate in the form of their coenzyme A (coA) esters in some rare inborn errors of metabolism. This concerns, for example, disorders in the degradation of branched-chain amino acids, such as isovaleric acidemia or propionic acidemia. In addition, they also assist in the elimination of ammonium, which is produced during the transamination of amino acids and accumulates in urea cycle defects. Sequence variants of the enzymes have also been investigated, which may provide evidence of impaired enzyme activities, from which therapy adjustments can potentially be derived.<br /> A modified Escherichia coli strain was chosen for the overexpression and partial biochemical characterization of the enzymes, which may allow solubility and proper folding. Since post-translational protein modifications are very limited in bacteria, we also attempted to overexpress the enzymes in HEK293 cells (human-derived). In addition to characterization via immunoblots and activity assays, intracellular localization of the enzymes was also performed using GFP coupling and confocal laser scanning microscopy in transfected HEK293 cells. The GLYATL2 enzyme may have tasks beyond detoxification and metabolic defects and the preliminary molecular biology work has been performed as part of this project - the enzyme activity determinations were outsourced to a co-supervised bachelor thesis.<br /> The enzyme activity determinations with purified recombinant human enzyme from Escherichia coli provided a threefold higher activity of the sequence variant p.(Asn156Ser) for GLYAT, which should be considered as the probably authentic wild type of the enzyme. In addition, a reduced activity of the GLYAT variant p.(Gln61Leu), which is very common in South Africa, was shown, which could be of particular importance in the treatment of isovaleric acidemia, which is also common in South Africa. Intracellularly, GLYAT and GLYATL1 could be localized mitochondrially.<br /> As the analyses have shown, sequence variations of GLYAT and GLYATL1 influence their enzyme activity. As an example, the GLYAT variant p.(Gln61Leu) is frequently found in South Africa. In the case of reduced GLYAT activity, patients could be increasingly treated with L-carnitine in the sense of an individualized therapy, since the conjugation of the toxic isovaleryl-coA with glycine is restricted by the GLYAT sequence variation. Activity-reducing variants identified in this project are of particular interest, as they may influence the treatment of certain metabolic defects.

Die humanen Enzyme GLYAT (Glyzin N-Azyltransferase), GLYATL1 (Glutamin N-Phenylazetyltransferase) und GLYATL2 (Glyzin N-Azyltransferase ähnliches Protein 2) sind nicht nur bei der Entgiftung von Fremdstoffen über die menschliche Leber wichtig, sondern auch an der Eliminierung von Azylresten beteiligt, die bei einigen seltenen angeborenen Stoffwechseldefekten in Form ihrer Coenzym A (CoA)-Ester akkumulieren. Dies betrifft zum Beispiel Störungen im Abbau von verzweigtkettigen Aminosäuren, wie die Isovalerianazidämie oder Propionazidämie. Daneben unterstützen sie auch bei der Elimination von Ammonium, welches bei der Transaminierung von Aminosäuren anfällt und sich bei Harnstoffzyklusdefekten anreichert. Es wurden auch Sequenzvarianten der Enzyme untersucht, die Hinweise auf eingeschränkte Enzymaktivitäten liefern können, woraus sich potentiell Therapieanpassungen ableiten lassen.<br /> Für die Überexpression und partielle biochemische Charakterisierung der Enzyme wurde ein modifizierter Escherichia coli Stamm gewählt, der die Löslichkeit und die korrekte Faltung ermöglichen kann. Da posttranslationale Proteinmodifikationen in Bakterien sehr limitiert sind, wurde außerdem versucht, die Enzyme in HEK293 Zellen (menschlicher Herkunft) zu überexprimieren. Neben der Charakterisierung über Immunoblots und Aktivitätsbestimmungen wurde auch die intrazelluläre Lokalisierung der Enzyme mittels GFP-Kopplung und konfokaler Laserscanning-Mikroskopie in transfizierten HEK293 Zellen durchgeführt. Für das GLYATL2-Enzym, für welches Aufgaben jenseits der Entgiftung und Stoffwechseldefekte postuliert wurden, sind die molekularbiologischen Vorarbeiten im Rahmen dieses Projekts durchgeführt worden - die Enzymaktivitätsbestimmungen wurden in eine mitbetreuten Bachelorarbeit ausgelagert.<br /> Die Enzymaktivitätsbestimmungen mit aufgereinigtem rekombinanten Human-Enzym aus Escherichia coli lieferten für GLYAT eine dreifach höhere Aktivität der Sequenzvariante p.(Asn156Ser), die als wahrscheinlich authentischer Wildtyp des Enzyms gelten sollte. Außerdem zeigte sich eine verringerte Aktivität der in Südafrika sehr häufigen GLYAT-Variante p.(Gln61Leu), was vor allem bei Behandlung der ebenfalls in Südafrika häufigen Isovalerianazidämie von Bedeutung sein könnte. Intrazellulär konnten GLYAT und GLYATL1 mitochondrial lokalisiert werden.<br /> Wie die Analysen gezeigt haben, beeinflussen Sequenzvariationen von GLYAT und GLYATL1 deren Enzymaktivität. Als Beispiel ist die in Südafrika häufig vorkommende GLYAT Variante p.(Gln61Leu) zu nennen. Im Falle verminderter GLYAT-Aktivität könnten Patienten im Sinne einer individualisierten Therapie vermehrt mit L-Carnitin behandelt werden, da die Konjugation des toxischen Isovaleryl-CoA mit Glyzin durch die GLYAT-Sequenzvariation eingeschränkt ist. Aktivitätsmindernde Varianten, die in diesem Projekt identifiziert wurden, sind dabei von besonderer Relevanz, da sie die Behandlung gewisser Stoffwechseldefekte beeinflussen können.