High-Throughput Phenotyping of Photosynthesis Traits in Durum Wheat Under Drought Stress Using Light-Induced Fluorescence Transients

Abstract

Agriculture in the twenty-first century faces the double challenge of feeding a growing population in a changing climate. Food security will increasingly rely on the active release of stable high-yielding cultivars with improved resilience to water shortages, particularly for vulnerable drought-prone environments. Therefore, developing new techniques and approaches to improve the efficiency and precision of crop breeding for drought tolerance is essential. Conventional plant phenotyping methods for assessing plant responses to water-limiting conditions, and supporting selective breeding, are usually laborious, time-consuming, and costly. More recently, cost-effective high-throughput phenotyping platforms (HTPPs) have emerged, enabling rapid and accurate phenotypic characterisation of large populations in either controlled or field conditions. HTPPs deploy sensors to non-invasively and non-destructively identify, quantify, and record relevant plant traits. An integrative signal, such as photosynthesis, may serve as a robust selection parameter for crop performance. Chlorophyll fluorescence (ChlF) is an inexpensive, fast, and non-invasive technique for probing photosynthesis and, therefore, for monitoring plant physiological status. Although proposed as a method for drought tolerance screening, ChlF has not yet been fully adopted in physiological breeding, mainly due to limitations in high-throughput phenotyping capabilities. Most of the prior research has relied on the pulse-amplitude modulation (PAM) fluorometry, which typically requires a saturating flash in very close proximity, done mainly by clamping on leaves, limiting its throughput. In this context, the Light-Induced Fluorescence Transient (LIFT) sensor arose as an alternative for acquiring high-throughput ChlF-based traits. The LIFT fluorometer actively monitors ChlF within milliseconds using subsaturating excitation flashlets instead of the saturating pulse. Also, this pump-and-probe method works at a distance, bridging the gap between leaf and canopy levels. LIFT-measured ChlF has proved to provide not only PAM-analogous photosynthetic parameters but also measures the downstream electron transport rates from the primary quinone acceptor (<em>Q</em>_A) to the plastoquinone (<em>PQ</em>) pool, and ultimately, towards the photosystem (PS) I. Nevertheless, little knowledge is available on the overall responses of LIFT-measured ChlF traits in field-grown crops under drought and their native genetic variability, aiding physiological crop breeding towards drought tolerance. To this end, the LIFT instrument was mounted on a manually pushed cart to measure ChlF across time in a large panel of durum wheat genotypes (> 220 elite accessions) subjected to progressive drought in replicated field trials over two growing seasons in Maricopa, Arizona, USA. Secondly, the LIFT sensor was combined with an existing automated HTPP for simultaneous and continuous monitoring of water relations in the soil-plant-atmosphere continuum of wheat plants growing in semi-controlled conditions. The photosynthetic performance was measured at the canopy level by means of the operating efficiency of PSII (<em>F</em>_<em>q</em>'⁄<em>F</em>_<em>m</em>') and the kinetics of electron transport from <em>Q</em>_A to <em>PQ</em> pool and from <em>PQ</em> pool to PSI measure by reoxidation rates, <em>F</em>_<em>r</em>1' and <em>F</em>_<em>r</em>2', respectively. Short- and long-term changes in ChlF traits were found in response to soil water availability and interactions with weather fluctuations, namely photosynthetic photon flux density (PPFD) and vapour pressure deficit (VPD). At an unprecedented scale, this high-throughput approach for phenotyping ChlF traits integrated with a high-resolution recording of the environment allowed for estimation of genetic effects over time and shed light on the diurnal dynamics of the photosynthetic apparatus, facilitating the ability to dissect complex physiological traits in fluctuating growing conditions.

Die Landwirtschaft steht im 21. Jahrhundert vor der doppelten Herausforderung, dass sie unter sich stets verändernden klimatischen Bedingungen eine wachsende Weltbevölkerung zu ernähren hat. Das Züchten neuer ertragsstabiler Sorten, welche den kontinuierlich verändernden Klimabedingungen standhalten beziehungsweise trockentolerant sind, wird insbesondere in wasserarmen Gebieten entscheidenden zur globalen Ernährungssicherung beitragen. Im Hinblick auf die Trockentoleranz ist daher die Entwicklung neuer Techniken und Ansätze zur Verbesserung der Effizienz und Präzision der Pflanzenzüchtung unerlässlich. Die Untersuchung pflanzlicher Reaktionen auf wasserlimitierende Bedingungen im Zusammenhang mit der selektiven Züchtung gestaltet sich oft schwierig, da herkömmliche Methoden der Pflanzenphänotypisierung in der Regel umständlich, zeitintensiv und kostspielig sind. Neuerdings wurden vermehrt kostengünstige Hochdurchsatz-Phänotypisierungsplattformen (HTPPs) entwickelt, die eine schnelle und akkurate phänotypische Charakterisierung großer Populationen unter kontrollierten und Feldbedingungen ermöglichen. HTPPs greifen auf Sensoren zurück, um relevante Eigenschaften von Pflanzen nicht-invasiv und nicht-destruktiv zu identifizieren, quantifizieren und aufzuzeichnen. Ein integratives Signal, wie die Photosynthese, könnte als robuster Selektionsparameter zur Beurteilung Leistungsfähigkeit der Pflanzen nutzbringend sein. Die Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz (ChlF) ist eine kostengünstige, schnelle sowie nicht-invasive Methode zur Untersuchung der Photosyntheseleistung, und somit zur Beobachtung des physiologischen Zustands der Pflanzen. Obschon die ChlF-Methode für das Screening trockentoleranter Sorten mitentwickelt wurde, findet sie bislang, noch keine breite Anwendung in der Pflanzenzüchtung, dies hauptsächlich aufgrund der Einschränkungen bei der Hochdurchsatz-Phänotypisierung. Der Großteil der bisherigen Forschung basiert auf der Puls-Amplituden-Modulation (PAM)-Fluorometrie, die typischerweise einen sättigenden Lichtblitz in unmittelbarer Nähe erfordert. Meistens erfolgt dies durch das Einklemmen von Blättern was aber Probendurchsatz stark begrenzt. Vor diesem Hintergrund wurde der ʻLight-Induced Fluorescence Transientʼ (LIFT)-Sensor entwickelt. Dieser stellt eine Alternative zur Erfassung von ChlF-basierten Eigenschaften mit hohem Durchsatz dar. Unter Verwendung von nicht-sättigenden Anregungs-Lichtblitzen anstatt des Sättigungspulses misst das LIFT-Fluorometer aktiv innerhalb von Millisekunden ChlF. Zudem ermöglicht dieses Pump-Probe-Verfahren eine Messung auf Distanz und überbrückt somit die Lücke zwischen Blattmessungen und Messungen auf Bestandsebene. Die ChlF Messung mit dem LIFT liefert nicht nur PAM-analoge photosynthetische Parameter, sondern misst auch die nachgeschalteten Elektronentransportraten vom primären Chinon-Elektronenakzeptor (<em>Q</em>_A) zum Plastochinon Pool (<em>PQ</em>), und schließlich zum Photosystem (PS) I. Dennoch ist nur wenig über die allgemeinen Reaktionen von LIFT-gemessenen ChlF-Eigenschaften unter trockenen Feldbedienungen und deren genetische Variabilität bekannt. Zur Datenerhebung wurde das LIFT-Gerät auf einem manuell geschobenen Wagen montiert um schließlich ChlF im zeitlichen Verlauf in einem großen Panel von Hartweizen-Genotypen (> 220 Elite-Akzessionen) zu messen. Die Weizenpflanzen wurden über zwei Wachstumsperioden in Maricopa, Arizona, USA, progressiver Trockenheit in Feldbedingungen ausgesetzt. Zur simultanen und kontinuierlichen Aufzeichnung der Wasserverhältnisse im Boden-Pflanze-Atmosphäre-Kontinuum wurden die LIFT Messungen mit einem automatisierten HTPP kombiniert. Die Photosyntheseleistung wurde auf Bestandesebene anhand der Quanteneffizienz des PSII (<em>F</em>_<em>q</em>'⁄<em>F</em>_<em>m</em>') sowie der Kinetik des Elektronentransport vom <em>Q</em>_A zum <em>PQ</em> Pool und vom <em>PQ</em> Pool zum PSI durch Reoxidationsraten beziehungsweise durch <em>F</em>_<em>r</em>1' und <em>F</em>_<em>r</em>2' gemessen. Kurz- und langfristige Veränderungen der ChlF-Eigenschaften konnten als Reaktion auf die Wasserverfügbarkeit im Boden und in Wechselwirkung mit Bedingungsschwankungen (photosynthetischen Photonenflussdichte und dem Sättigungsdampfdruckdefizit) nachgewiesen werden. Dieser Hochdurchsatz-Ansatz zur Phänotypisierung von ChlF-Eigenschaften, verknüpft mit einer hochauflösenden Aufzeichnung der Umweltdaten, ermöglicht in einem erstmaligen Ausmaß die Schätzung von genetischen Effekten im zeitlichen Verlauf. Zudem verdeutlicht er die tageszeitliche Dynamik des photosynthetischen Apparates mit der Fähigkeit komplexe physiologische Eigenschaften unter schwankenden Wachstumsbedingungen getrennt zu betrachten.