Mechanisms and systemic relevance of immune cell specific virus replication

Cells of the immune system build the first line of defense against invading pathogens such as viruses. Virus replication in various cells initiates the induction of an interferon dependent, anti-viral immune response e.g., by activating pattern recognition receptors (PRRs) such as Toll-like receptors. The anti-viral status in these cells usually represses viral replication and prevents viral spread and a fatal outcome of the infection. Strikingly, under normal conditions, specialized cells of secondary lymphoid organs (SLOs) display enhanced virus replication. These cells, mainly marginal zone CD169+ macrophages and dendritic cells (DCs), express high constitutive levels of the interferon signaling repressor USP18. USP18 substitutes for JAK1 at the interferon-α/β receptor (IFNAR) and thereby decelerates the anti-viral interferon signaling and promotes virus replication. This mechanism known as enforced virus replication (EVR) was shown to be essential in the control of VSV infection by the production of sufficient amounts of virus antigen to enhance activation of innate and adaptive immunity. The influence of USP18 mediated EVR on the outcome of immunization with a live attenuated virus vaccine or other natural virus infections remained yet to be unknown.

Ebola viruses are endemic to Africa, and mainly spread in humans through direct exchange of body fluids. Ebola virus infection is often fatal before the virus has had a chance to broadly spread. The first Ebola virus vaccine (Ervebo, VSV-EBOV) was approved by the U.S. Food and Drug Administration (FDA) in 2019 and has been found to be safe and protective against Zaire Ebola virus, which has caused the largest and most deadly Ebola virus outbreaks to date. In the first part of this work, we investigated the influence of EVR on the outcome of immunization with the live attenuated Ebola virus vaccine VSV-EBOV. We established a mouse model carrying a CD169+ cell specific gene knockout of Usp18 (CD169-Cre+/ki x Usp18fl/fl), which circumvents the disadvantageous effects of conventional USP18 knockouts on the development of distinct cell subsets. VSV infection in control mice demonstrated an increase of viral antigen in CD169+ macrophages upon systemic and local virus infection dependent on USP18 expression. USP18 deletion in CD169+ macrophages of CD169-Cre+/ki x Usp18fl/fl mice decreased type I interferon production and enhanced susceptibility to neurovirulence and lethality of VSV infection, which was strongly associated with poor induction of protective VSV neutralizing antibodies. Using the clinically available attenuated VSV-EBOV vaccine (Ervebo) we demonstrated that USP18 driven EVR is essential to amplify VSV-EBOV virus antigen in CD169+ macrophages. Such an enforced VSV-EBOV replication in control mice induced a significantly increased type I interferon dependent innate immune response compared to CD169-Cre+/ki x Usp18fl/fl mice, which finally was necessary to introduce a protective immune status by the induction of a strong Ebola virus glycoprotein neutralizing antibody response.

EVR was yet shown to be essential for the control of a VSV infection, but it is unclear if EVR also plays a role in virus infections relevant for humans. Therefore, in the second part, we investigated the mechanism and impact of immune cell specific Influenza A virus (IAV) replication in SLOs on the activation of anti-viral immunity. Upon systemic IAV infection, we demonstrated receptor mediated IAV uptake into dendritic cells (DCs) and CD169+ macrophages of the spleen. Repression of viral progression by UV inactivation of IAV, receptor removal and viral spread inhibition all significantly impaired the induction of anti-IAV innate and adaptive immunity. Expression of the interferon signaling inhibitor USP18 was essential to drive IAV replication in CD169+ macrophages and DCs. We also demonstrated that USP18 dependent EVR of IAV in secondary lymphoid organs contributed considerably to the activation of an innate type I interferon driven and adaptive anti-viral T cell immune response.

Taken together, we demonstrated for the first time that USP18 mediated virus replication in specialized immune cells of SLOs is an essential mechanism to induce protective immune status after the immunization with live attenuated VSV-EBOV vaccine and natural IAV infection.

Die Zellen des Immunsystems die erste Barriere gegen in den Körper eindringende Pathogene wie Viren. Die Virusreplikation in unterschiedlichen Zellen initiiert die Induktion einer Interferon-abhängigen, angeborenen Immunantwort beispielsweise durch die Aktivierung von Pattern Recognition Rezeptoren (PRRs) wie Toll-like Rezeptoren. Der anti-virale Status dieser Zellen unterdrückt für gewöhnlich die Virusreplikation und verhindert so die Ausbreitung des Virus sowie einen letalen Ausgang der Infektion. Interessanter Weise zeigen spezialisierte Zellen in sekundären lymphoiden Organen (SLO) unter normalen Konditionen verstärkte Virusreplikation. Diese Zellen, hauptsächlich CD169+ Marginalzonenmakrophagen und Dendritische Zellen, exprimieren konstitutiv hohe Level des Interferon-Signalweg Inhibitors USP18. USP18 ersetzt JAK1am Interferon-α/β Rezeptor (IFNAR), verlangsamt so den Interferon-Signalweg und begünstigt die Virusreplikation. Es wurde gezeigt, dass dieser Mechanismus, bekannt als forcierte Virusreplikation (FVR), essenziell für die Kontrolle einer VSV Infektion, durch die Generierung ausreichender Virusantigenmengen für die Verstärkung der angeborenen und adaptiven Immunantwort, ist. Der Einfluss der USP18 -abhängigen FVR auf das Ergebnis der Immunisierung mit einem lebend-attenuierten Virus-Vakzin oder natürlich vorkommenden Virusinfektionen war bisher nicht erforscht.

Ebolaviren sind in Afrika endemisch und verbreiten sich hauptsächlich im Menschen durch direkten Austausch von Körperflüssigkeiten. Ebolavirus Infektionen sind häufig fatal, bevor das Virus sich verbreiten kann. Der erste Ebolavirus Impfstoff (Ervebo, VSV-EBOV), wurde durch die U.S. Food and Drug Administration (FDA) 2019 zugelassen und zeigte sich als sicher und protektiv gegen das Zaire Ebolavirus, welches den bisher größten und fatalsten Ebolavirus Ausbruch verursacht hat. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss FVR auf das Ergebnis der Immunisierung mit dem lebend-attenuierten Ebolavirus Impfstoff VSV-EBOV untersucht. Es wurde ein Maus-Model mit einem CD169+ zellspezifischen Usp18-Gen-Knockout etabliert (CD169-Cre+/ki x Usp18fl/fl), durch welches sich die nachteiligen Effekte eines konventionellen Usp18-Gen-Knockout auf die Zellentwicklung spezifischer Immunzellen umgehen lassen konnten. Systemische und lokale VSV Infektionen führten in diesem Maus-Model zu einer USP18-abhängigen Erhöhung von viralen Antigenen in CD169+ Makrophagen. Die Deletion von USP18 in CD169+ Makrophagen der CD169-Cre+/ki x Usp18fl/fl Mäuse verringerte die Typ I Interferon Produktion und erhöhte die Suszeptibilität gegenüber der Neurovirulenz und Letalität einer VSV Infektion, was darüber hinaus mit einer schwachen Induktion von VSV neutralisierenden Antikörpern assoziiert war. Durch die Verwendung des in klinischer Anwendung befindlichen Ebolavirus Vakzins VSV-EBOV (Ervebo) wurde gezeigt, dass USP18-mediierte FVR essenziell für die Amplifikation von VSV-EBOV in CD169+ Makrophagen ist. Diese forcierte VSV-EBOV Replikation induzierte in Kontrollmäusen eine signifikant erhöhte Typ I Interferon-abhängige, angeborene Immunantwort im Vergleich zu CD169-Cre+/ki x Usp18fl/fl Mäusen, was schlussendlich unabdingbar für die Ausbildung eines protektiven Immunstatus, durch die Induktion einer starken Ebolavirus Glykoprotein neutralisierenden Antikörperantwort, war.

Die FVR wurde als essenziell für die Kontrolle einer VSV Infektion gezeigt, jedoch ist der Einfluss der FVR auf Infektionen mit relevanten Humanpathogenen unklar. Aufgrund dessen, wurde im zweiten Teil dieser Arbeit der Mechanismen und Einfluss von Immunzell-spezifischer Influenza A Virus (IAV) Replikation in SLO auf die Aktivierung der anti-viralen Immunantwort untersucht. Durch eine systemische IAV Infektion wurde die Rezeptor-mediierte Aufnahme von IAV in Dendritische Zellen (DZ) und CD169+ Makrophagen der Milz gezeigt. Durch die Repression der viralen Progression durch UV-Inaktivierung des IAV, sowie das Entfernen des viralen Eintritt-Rezeptors und die Inhibition der viralen Ausbreitung wurde die Induktion einer gegen IAV gerichteten angeborenen und adaptiven Immunantwort stark beeinflusst. Die Expression des Interferon-Signalweg Inhibitors USP18 war essenziell, um die IAV Replikation CD169+ Makrophagen und DZ zu begünstigen. Weiterhin wurde gezeigt, dass USP18-mediierte FVR von IAV in sekundären lymphoiden Organen maßgeblich zur Aktivierung einer angeborenen Typ I Interferon abhängigen und adaptiven anti-virale T Zell Immunantwort beiträgt.

Zusammenfassend wurde zum ersten Mal gezeigt, dass eine USP18-abhängige Virusreplikation in spezialisierten Immunzellen sekundärer lymphoider Organe ein essenzieller Mechanismus zur Induktion eines protektiven Immunstatus nach einer Immunisierung mit der lebend-attenuierten Vakzine VSV-EBOV, sowie für natürliche Influenza Infektionen ist.

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