Einfluss der additiven Interaktion von Retinolsäure und BMP-4 auf die Apoptose humaner RB-Zelllinien und Vermittlung der apoptotischen Signalkaskade in WERI-Rb1 Retinoblastom-Zellen
Retinoide sind als Schlüsselmoleküle in der Karzinogenese vieler Tumore involviert und werden bereits als therapeutische Agentien eingesetzt. Durch Zellkulturversuche konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation gezeigt werden, dass die gleichzeitige Applikation von Retinolsäure (RA) und Knochenwachstumsfaktor bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) zu einer additiven Apoptoseinduktion in verschiedenen Retinoblastom (RB)-Zelllinien führt. In dieser Arbeit wurde die durch RA/BMP-4 additiv gesteigerte Apoptoseinduktion in WERI-Rb1 RB-Zellen näher charakterisiert und die zugrundeliegende Apoptose-Signalkaskade sowie involvierte Rezeptoren detailliert analysiert. Zellkulturversuche, basierend auf der intrazellulären Blockade von Caspasen sowie einer immunzytochemischen Behandlung mit einem aktivierten Caspase-3-Antikörper, zeigten, dass die additive Apoptoseinduktion durch RA und BMP-4 zu einem Großteil Caspase-abhängig über den Signalweg der intrinsischen Caspase-3 vermittelt wird. RA und BMP-4 führten zudem zu einer additiven Induktion von Apaf-1 und zu einer gesteigerten Spaltungsaktivität der Initiator-Caspase-9, was die durch RA und BMP-4 gesteigerte Proteinexpression der aktivierten Caspase-3 erklärt. Per polymerase chain reaction (PCR)-Studien konnte gezeigt werden, dass RA und BMP-4 die Rezeptorsubtypen retinoic acid receptor α(RARα), RARβ, retinoic X receptor β(RXRβ) und RXRγ sowie bone morphogenetic protein receptor II (BMPR II) auf messenger ribonucleic acid (mRNA)-Ebene induzieren. Zudem wurde durch Agonisten-Studien demonstriert, dass sowohl Retinsäure-Rezeptoren (RARs) als auch Retinoid X-Rezeptoren (RXRs) an der additiv gesteigerten Apoptose in WERI-Rb1 Zellen beteiligt sind. Zur näheren Charakterisierung der beteiligten Rezeptor-Subtypen wurden RAR-Antagonisten-Studien sowie ein RXRβ- und RXRγ-Genknockdown durchgeführt. So konnte dargelegt werden, dass die additive Apoptoseinduktion durch die Subtypen RARα, RARβ, RXRβ und RXRγ vermittelt wird. RA weist zudem die Fähigkeit auf mit cellular retinoic acid binding protein II (CRABP II), dessen Expression durch RA/BMP-4 Doppelbehandlung signifikant hochreguliert wird, zu interagieren und so die Gentranskription und die Apoptose zu verstärken. Zusammenfassend stellt die vorliegende Dissertation eine prospektive Grundlage für zukünftige Retinoid- bzw. Rexinoid-basierte Therapiestrategien für das Retinoblastom dar.
Retinoids are already used and discussed as promising therapeutic agents for the treatment of various human cancers. In the present dissertation, combined application of recombinant retinoic acid (RA) and bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) resulted in an additive apoptosis induction in different retinoblastoma (RB) cell lines. In the study presented, the mechanisms behind this interaction and the involved receptors were analysed in WERI-Rb1 cells. Blocking experiments with a general caspase inhibitor showed that RA and BMP4 induced apoptosis in WERI-Rb1 cells is at least partially caspase-dependent. Immunocytochemical staining with a specific cleaved caspase-3 antibody revealed that RA and BMP4 additively mediate apoptosis via the caspase-3 pathway. Thus, RA and BMP-4 additively increased Apaf-1 mRNA levels and caspase-9 cleavage activity. PCR analyses showed that combined application of RA and BMP-4 enhances messenger ribonucleic acid (mRNA) levels of the retinoic acid receptors (RARs) RARα and RARßand the retinoic X receptor (RXR) RXRγ as well as mRNA levels of the bone morphogenetic protein receptor II (BMPR II). By performing agonist studies, it was proved that both RARs and RXRs are involved in RA/BMP-4 additively enhanced apoptosis in WERI-Rb1 cells. Using specific RAR subtype antagonists and a RXRß and RXRγ geneknockdown, it was shown that additive apoptosis induction of RA and BMP-4 in WERI-Rb1 cells requires the subtypes RARα, RARß, RXRß and RXRγ. Besides, combined RA/BMP-4 treatment significantly up-regulated cellular retinoic acid binding protein II (CRABP II) mRNA levels, indicating another mechanism of augmenting additive apoptosis induction by RA and BMP-4. In conclusion, the present dissertation provides useful starting-points for future retinoid-based therapy strategies of retinoblastoma.