Molecular pathogenesis of nodular lymphocyte-predominant Hodgkin lymphoma and related neoplasias
Nodular lymphocyte-predominant Hodgkin lymphoma (NLPHL) is the only non-classical subtype of Hodgkin lymphoma (HL), accounting for approximately 5% of HL cases. The hallmark of HL is a low percentage of tumor cells of ≤1%, called Hodgkin Red-Sternberg (HRS) cells in cHL and lymphocyte-predominant (LP) cells in NLPHL, scattered within an abundant reactive infiltrate. In comparison to classical HL (cHL), NLPHL predominantly affects males (75%), and NLPHL patients more frequently present with early stage disease and an indolent clinical course. However, relapses and transformation into aggressive B-cell lymphomas occur more often in NLPHL. Despite the identification of some genetic factors contributing to the development of NLPHL, the molecular pathogenesis of this lymphoma entitiy is largely unsolved. Due to their rarity and the low tumor cell content primary cases of NLPHL have not been investigated yet by whole exome sequencing (WES). The aim of the present thesis was to identify molecular events and genetic factors playing a role in the pathogenesis of NLPHL as well as in its transformation process into T cell/histiocyte-rich large B-cell lymphoma (THRLBCL) and diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL).
In the first part of this thesis, ten primary cases of NLPHL were investigated by WES to identify mutated genes that may be implicated in the pathogenesis of NLPHL. For this purpose, 3000 LP cells were laser-microdissected from frozen tissue of lymphoma patients followed by enrichment of the genomic DNA by whole genome amplification (WGA). Peripheripheral mononuclear cells (PBMCs) or microdissected non-tumor cells (NTCs) processed like the LP cells served as matched normal DNA. In order to compensate the WGA bias of randomly introduced polymerase errors, duplicate reactions of each LP cells and NTCs were sequenced, identifying somatic mutations by the presence in both LP WGA reaction and the absence in the normal DNA. Though covering a major fraction of the exome of ≥70% in the majority of cases, regions of interest with a high GC-content, including known recurrently mutated genes in NLPHL, were not covered by a sufficient number of sequencing reads. Consequently, the mutational status of these genes of interest remained unknown in the present NLPHL cohort, representing a main limitation of this method. A median number of 27 single nucleotide variants (SNVs) per case was detected, including a median number of 9 non-silent SNVs per case. Several genes involved in important biological processes and signaling pathways harbored non-silent somatic SNVs in the ten cases. However, of 146 genes affected by non silent SNVs only five genes showed recurrent somatic mutations. The pathogenic relevance of these genes in NLPHL remains to be explored in future studies.
In the second part of this thesis, nine primary cases of THRLBCL were analyzed for the presence of nonsynonymous SNVs in 62 genes associated with somatic mutation in NLPHL by ultra-deep targeted resequencing (UDTR). This sequencing approach demonstrated that a considerable fraction of genes (31 genes, 50%) associated with somatic mutation in NLPHL was also affected by mutation in primary cases of THRLBCL. The genes JUNB, DUSP2 and SGK1, previously identified as novel genes recurrently mutated in NLPHL, as well as SOCS1, known to be frequently mutated in HL, were among the most recurrently mutated genes in THRLBCL. These findings pointed to a close relationship of NLPHL and THRLBCL on the basis of somatically mutated genes, as it had been suggested in previous work based on similar gene expression profiles and common genomic imbalances of the tumor cells of both tumor entities. Since SOCS1 was significantly more frequently mutated and showed an increased number of SNVs in THRLBCL compared to NLPHL, SOCS1 may act as progression driver in the NLPHL spectrum. Moreover, the mutation pattern in the most frequently mutated genes in the cohort JUNB, DUSP2, SGK1 and SOCS1 suggested that these genes represent targets of aberrant somatic hypermutation (ASHM), implying an important role of ASHM in the generation of somatic mutations and thus in the pathogenesis of NLPHL and THRLBCL.
The third part of the present thesis aimed to assess the functional relevance of the serum and glucocorticoid-regulated kinase 1 (SGK1) in NLPHL. Elevated SGK1 expression and/or activity are observed in several human tumors; however, its role in NLPHL is unknown. Since potential STAT binding motifs were identified in the promoter region of SGK1, a regulation of SGK1 by the JAK/STAT signaling pathway was studied. Inhibition of JAK2 abolished SGK1 expression in lymphoma cell lines, and stimulation of JAK/STAT signaling with IL-21 induced SGK1 expression in a STAT3-dependent manner in two of three cell lines analyzed, confirming the hypothesis that SGK1 represents a transcriptional target of the JAK/STAT signaling pathway in NLPHL and related lymphomas. These results indicated that constitutive active JAK/STAT signaling in HL stimulates SGK1 expression in these lymphomas. Furthermore, inhibition of SGK1 activity in lymphoma cell lines induced apoptosis in cell lines of NLPHL and GCB DLBCL origin, demonstrating moderate to high SGK1 expression, whereas the viability of BL cell lines, characterized by low SGK1 expression, was not affected. This finding suggested that cell survival of at least a fraction of lymphoma cell lines depends on SGK1 activity. To silence SGK1 expression in the NLPHL cell line DEV and the BL cell line Daudi, shRNA-mediated downregulation was performed by lentiviral transduction. While the cellular behavior of the BL cell line Daudi was not impaired in response to SGK1 downregulation, the results obtained for the NLPHL cell line DEV were dependent on the transduction efficiency. Highly efficient lentiviral transduction of the cell line DEV with shRNA against SGK1 in one experiment resulted in induction of apoptosis and an impaired proliferation ability, whereas the cellular behavior of poorly transduced DEV cells enriched by cell sorting was not affected. In conclusion, this thesis provides evidence that SGK1 may exhibit an oncogenic function in NLPHL and related lymphomas by promoting cell survival and mediating rescue from apoptosis.
Preliminary work revealed an inflammatory response of the tumor microenvironment in DLBCL transformed from NLPHL (LP DLBCL) compared to conventional DLBCL. Therefore, the aim of the final part of this thesis was to investigate the influence of a prominent inflammatory microenvironment in LP DLBCL mainly composed of T cells and macrophages on LP tumor cells in a cell culture model. This in-vitro model consisted of the cell line DEV, which is the only available cell line established from an NLPHL, cocultivated with T cells or monocytes isolated from human PBMCs. Cocultivation of DEV cells with T cells or monocytes induced growth inhibition in DEV cells, which was reflected by downregulation of positive regulators of cell cycle progression and upregulation of cell cycle inhibitors on the molecular level. This finding suggested that the inflammatory microenvironment in LP-DLBCL has the capacity to suppress the tumor cell proliferation in vitro, offering an explanation for the lower tumor cell content in LP-DLBCL compared to conventional DLBCL. The most strongly downregulated gene in DEV cells after coculture was MYC. A lack of MYC was detected by immunohistochemistry in the majority of LP-DLBCL patients, distinguishing LP-DLBCL from conventional DLBCL. The inflammatory microenvironment in LP-DLBCL indicates an ongoing immune response in LP-DLBCL patients, the tumor cells escaped from by various stretegies, e.g. downregulation of MHC molecules and expression of PD-L1. The ongoing immune response in LP-DLBCL may be enhanced by treatment of patients with checkpoint inhibitors.
Das noduläre lymphozytenprädominante Hodgkin-Lymphom (NLPHL) ist der einzige nicht klassische Subtyp des Hodgkin-Lymphoms (HL), der mit einem Anteil von etwa 5% unter allen HLs auftritt. Das histologische Bild des HLs ist durch einen geringen Anteil an Tumorzellen von ≤1% gekennzeichnet, die zufällig in einem reaktiven Begleitinfiltrat verteilt sind. Die Tumorzellen des HLs stammen von B-Zellen der Keimzentren ab, wobei aufgrund von unterschiedlicher Morphologie und immunologischer Markerexpression zwischen Hodgkin- und Reed-Sternbergzellen des cHLs und lymphozytenprädominanten (LP) Zellen des NLPHLs unterschieden wird. Im Vergleich zum cHL betrifft das NLPHL überwiegend Männer (75%) und wird häufiger in frühen Stadien und mit einem indolenten klinischen Verhalten diagnostiziert. Allerdings kommt es beim NLPHL häufiger als beim cHL zur Entstehung von Rezidiven sowie zur Transformation in aggressive Non-Hodgkin-Lymphome (NHLs), wie dem diffusen großzelligen B-Zelllymphom (DLBCL) und dem T Zell/histiozytenreichen B-Zell-Lymphom (THRLBCL). Aufgrund der Seltenheit und des geringen Tumorzellgehalts des NLPHLs gestaltet sich die molekulare Untersuchung der LP Zellen als technisch schwierig, weshalb die Pathogenese des NLPHL noch nicht vollständig aufgeklärt werden konnte. Die LP-Zellen wurden bislang noch nicht durch eine Exom Sequenzierung charakterisiert, so dass ihr Mutationsprofil und dessen Unterschiede zu den HRS-Zellen noch weitgehend unbekannt sind. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, molekulare Mechanismen und genetische Faktoren zu identifizieren, die zur Enstehung des NLPHLs und dessen Transformationsprozess in aggressive NHLs beitragen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die LP-Zellen zehn primärer NLPHL-Fälle mittels Exom Sequenzierung analysiert. Im Vorfeld wurden hierfür 3000 LP-Zellen pro Fall mittels Mikrodissektion aus Gewebeschnitten isoliert und die genomische DNA der Tumorzellen anschließend durch Gesamtgenomamplifizierung (WGA) vervielfältigt. Als Normal-DNA wurden je nach Verfügbarkeit mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) oder mikrodissektierte Nicht-Tumorzellen (NTCs) verwendet. Zur Unterscheidung von Polymerasefehlern, die während des WGA-Prozesses zufällig in die DNA eingefügt werden, von tatsächlichen somatischen Mutationen, wurden die mikrodissektierten LP-Zellen und NTCs in Duplikaten sequenziert. Eine echte somatische Mutation wurde durch das Vorhandensein in beiden WGA-Replikaten der LP-Zellen und der Abwesenheit in der entsprechenden Normal-DNA definiert. In der Mehrheit der Fälle wurden mindestens 70% des Exoms durch eine ausreichende Anzahl an unterschiedlichen Sequenzen abgedeckt, wobei die Abdeckung des Exoms in den LP-Zellen etwas schlechter ausfiel als in den NTCs. Trotz der ausreichenden Abdeckung eines Großteils des Exoms, wurden besonders GC-reiche Regionen schlecht in der WGA amplifiziert. Innerhalb der durch die WGA schlecht amplifizierten Bereiche waren unter anderem die kodierenden Exons von Genen lokalisiert, die bekanntermaßen im NLPHL von rekurrenten Mutationen betroffen sind. Somit konnte der Mutationsstatus dieser Gene in den zehn NLPHL Fällen nicht untersucht werden, was einen deutlichen Nachteil der WGA darstellt, und vermutlich dazu führt, dass die Anzahl an Einzelnukleotid-Varianten (SNVs) pro Fall zu gering eingestuft wurde. Insgesamt konnte pro Fall eine mediane Anzahl von 27 synonymen und nicht synonymen SNVs identifiziert werden, wobei 9 nicht-synonyme SNVs vorlagen. Von insgesamt 146 Genen, die von nicht synonymen SNVs betroffen waren, waren fünf Gene rekurrent in zwei Fällen mutiert. Die von Mutationen betroffenen Gene ließen sich einer Vielzahl von biologischen Prozessen und Signalwegen zuordnen. Die pathogene Bedeutung der vor allem rekurrent mutierten Gene muss in zukünftigen Studien näher untersucht werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden neun primäre THRLBCL-Fälle auf eine Ähnlichkeit ihres Mutationsprofils zu primären NLPHL-Fällen untersucht, indem eine ultra-tiefe Amplikon Resequenzierung von 62 Genen durchgeführt wurde. Die untersuchten Gene waren in einer vorangegangenen Studie mit somatischen Mutationen in primären NLPHL Fallen assoziiert. Insgesamt zeigten die THRLBCL-Fälle nicht-synonyme SNVs in 31 der untersuchten Gene (50%), wobei 13 Gene (21%) rekurrente Mutationen aufwiesen. Zu den am häufigsten rekurrent mutierten Genen gehörten die Gene JUNB, DUSP2 und SGK1, die erst kürzlich als neue Zielgene somatischer Mutationen im NLPHL beschrieben wurden, sowie SOCS1, das häufig Mutationen im HL aufweist. Dieses Ergebnis deutet auf eine enge Verwandtschaft zwischen den beiden Lymphomentitäten hin, die sich neben einer großen Ähnlichkeit der Genexpressionsprofile sowie gemeinsamer struktureller genomischer Läsionen, auch auf Ebene somatischer SNVs zeigt. Im Vergleich zum NLPHL, war SOCS1 im THRLBCL signifikant häufiger nicht-synonym mutiert und von einer größeren Anzahl an SNVs betroffen, weshalb SOCS1 einen Progressionsmarker im Spektrum des NLPHLs darstellen könnte. Weiterhin ließ das Mutationsmuster in den am häufigsten mutierten Gene JUNB, DUSP2, SGK1 und SOCS1 auf eine Beteiligung der aberranten somatischen Hypermutation (ASHM) schließen, der somit eine wichtige Rolle in der Enstehung von somatischen Mutationen im NLPHL und THRLBCL und in der Pathogenese beider Lymphomentitäten zukommt.
Der dritte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der funktionellen Charakterisierung der Serin/Threonin-Proteinkinase SGK1 im NLPHL. Eine erhöhte SGK1-Expression und –Aktivität wird mit vielen Tumorarten in Verbindung gebracht, jedoch ist die Rolle von SGK1 im NLPHL noch unbekannt. Da sich in der Promoterregion von SGK1 potentielle Bindemotife für STAT Transkriptionsfaktoren befinden, wurde zunächst eine Beteiligung des JAK/STAT Signalwegs in der Regulation der SGK1-Expression untersucht. Eine Inhibierung des JAK/STAT Signalwegs in Lymphomzelllinien führte zu einer verringerten SGK1-Expression, während eine Stimulation dieses Signalswegs mit IL-21 eine STAT3-abhängige Erhöhung der SGK1-Expression in zwei von drei Zelllinien zur Folge hatte. Diese Beobachtungen bestätigen die Hypothese, dass SGK1 ein transkriptionelles Zielgen des JAK/STAT Signalwegs ist, dessen konstitutive Aktivität im HL vermutlich die Expression von SGK1 induziert. Weiterhin löste die Inhibierung der SGK1-Kinaseaktivität in Lymphomzelllinien mit hoher SGK1-Expression (NLPHL und GCB-DLBCL Ursprung) Apoptose aus, während Zelllininen mit schwacher SGK1 Expression (BL Ursprung) keine zelluläre Beeinträchtigug zeigten. Darüberhinaus wurde die SGK1-Expression durch lentivirale Transduktion mittels shRNA herunterreguliert. Während eine Herabregulation von SGK1 in der BL-Zelllinie Daudi keine Auswirkungen auf das Zellüberleben und die Proliferationsfähigkeit hatte, war das Resultat in der NLPHL Zelllinie DEV abhängig von der Transduktionseffizienz. Eine hocheffiziente Transduktion der Zelllinie DEV mit der gegen SGK1 gerichteten shRNA führte zur Induktion von Apoptose und einer verminderten Zellproliferation, wohingegen schwach transduzierte Zellen, die mittels Fluoreszenz aktivierter Zellsortierung (FACS) angereichert wurden, keine Beeinträchtigung des zellulären Verhaltens zeigten. Insgesamt lassen die erzielten Ergebnisse vermuten, dass SGK1 eine Rolle in der Vermeidung von Apoptose und der Förderung der Zellproliferation im NLPHL und verwandten Lymphomen spielt und somit eine onkogene Funktion in diesen Entitäten besitzen könnte.
In Vorarbeiten wurden primäre DLBCL-Fälle, die nach Transformation aus dem NLPHL entstanden sind (LP-DLBCL), im Vergleich zu konventionellen DLBCL-Fällen mittels Genexpressionsanalysen charakterisiert. Das LP-DLBCL zeichnete sich durch eine Signatur aus, die auf eine ausgeprägte entzündliche Immunantwort der Tumormikroumgebung hindeutete. Daher wurde im letzten Teil dieser Arbeit der Einfluss eines entzündlichen Begleitinfiltrats im LP-DLBCL, das überwiegend aus T-Zellen und Makrophagen besteht, auf die LP Zellen in einem in-vitro Modell untersucht. Dafür wurde die einzige existierende NLPHL-Zelllinie DEV mit primären humanen T-Zellen oder Monozyten ko-kultiviert, die aus PBMCs isoliert wurden. Diese Ko-Kultvivierung hatte eine Wachstumshemmung der Zelllinie DEV zur Folge, die sich auf molekularer Ebene durch Herabregulation von Faktoren, die ein Fortschreiten des Zellzyklus begünstigten, und einer Hochregulation von Zellzyklusinhibitoren äußerte. Aus dieser Beobachtung lässt sich schließen, dass die entzündliche Mikroumgebung im LP-DLBCL die Proliferationsfähigkeit der Tumorzellen unterdrücken kann. Diese wachstumshemmenden Eigenschaften der Mikroumgebung im LP DLBCL liefern eine Erklärung für den geringen Tumorzellgehalt im LP-DLBCL gegenüber dem konventionellen DLBCL. Das nach Ko kultivierung am stärksten herunterregulierte Gen in der Zelllinie DEV war MYC. Durch immunhistochemische Analysen primärer LP-DLBCL Fälle konnte eine fehlende Ausprägung von MYC in den Tumorzellen nachgewiesen werden, wodurch sich das LP-DLBCL vom konventionellen DLBCL unterscheidet. Das entzündliche Begleitinfiltrat im LP-DLBCL zeigt eine bereits eingeleitete Immunantwort an, der sich die Tumorzellen durch Anwendung verschiedener Strategien, wie z.B Herabregulation von MHC Molekülen und Ausbildung von PD-L1, entziehen. Durch die Behandlung der LP-DLBCL Patienten mit Checkpoint-Inhibitoren könnte eine erhöhte Immunogenität erzielt werden und somit der klinische Verlauf verbessert werden.