Schneller quantitativer Immunassay für die parallelisierte hochsensitive Vor-Ort-Diagnostik mit maßgeschneiderten, selbstassemblierten SERS-aktiven 3D-Superstrukturen
In der vorliegenden Arbeit wurde ein sensitiver, quantitativer und waschfreier Multiplex-Immunassay für die patientennahe Labordiagnostik (engl. point-of-care-testing, POCT) entwickelt. Das Auslesen erfolgte über die oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie (engl. surface-enhanced Raman scattering, SERS). Dies erfordert neben signalstarken und lichtstabilen SERS-aktiven Nanopartikeln, bestehend aus Edelmetallnanopartikeln und Raman-aktiven Molekülen auf der Partikeloberfläche, als Markierungsmittel auch ein portables Raman-Auslesegerät. SERS-Signale von einzelnen Goldnanostrukturen (Goldnanosterne und Au/Au-Kern/Satelliten-Partikel) konnten gezeigt sowie die Signalstärke der Partikel durch FEM-basierte elektromagnetische Computersimulationen auch theoretisch bestätigt werden. Die bisher in den immunchromatographischen Tests (engl. lateral flow assay, LFA) verwendeten Marker wie sphärische Goldnanopartikel, Fluoreszenzfarbstoffe oder farbige Polymerkügelchen erlauben nur eine visuelle, d.h. qualitative oder, in Kombination mit einem POC-Auslesegerät, eine semiquantitative Auswertung. Eine Detektion von mehreren Zielmolekülen (Multiplexing) kann (sofern überhaupt möglich) nur räumlich getrennt erfolgen.
Die in dieser Arbeit verwendeten SERS-Nanopartikel konnten erfolgreich in die bestehende LFA-Technologie implementiert werden und vergleichbare visuelle Ergebnisse mit komplexen Proben, wie einer klinischen Serumsprobe, erzielt werden: 15-fach niedriger für die klinische Probe bzw. 100-fach niedriger für ein gereinigtes System aus mehreren Tumormarkern. Darüber hinaus konnte die Nachweisgrenze über den SERS-Ausleseprozess deutlich herabgesetzt werden. Ein Multiplexing für den Parallelnachweis von proinflammatorischen Zytokinen konnte auf einer Membran gezeigt werden, sowohl räumlich getrennt auf zwei Testzonen als auch simultan auf derselben Testzone. Für die Quantifizierung konnte mit einem hausintern entwickelten portablen Raman-Auslesegerät die gesamte Testzone innerhalb einer Gesamtauslesezeit von nur 5 s erfasst und detektiert werden. Im Vergleich zu den bisher entwickelten SERS-basierten LFA mit konventionellen nicht-portablen und teuren Raman-Mikroskopen ist dies ein großer Entwicklungsfortschritt hinsichtlich einer SERS-Anwendung in der POCT, da die Auslesezeit von mindestens 2-3 Größenordnungen verringert werden konnte.
Die SERS-Technologie löst somit die bisherigen Limitierungen der LFA-Technologie, indem sie hohe Empfindlichkeit (z.B. für die Früherkennung), Quantifizierbarkeit (bisher nur semiquantitativ) und Multiplexing für den Parallelnachweis (zeit- und kostensparend) mit hoher Auslesegeschwindigkeit (portables SERS-Lesegerät) kombiniert. Aufgrund der generellen Anwendbarkeit der SERS-LFA-Technologie können ihre Vorteile auch in anderen Bereichen, in denen konventionelle LFA zum Einsatz kommen, genutzt werden. Denkbar sind z.B. Anwendungsgebiete von der Lebensmittelanalytik bis hin zum Nachweis von Drogen und biologischen Kampfstoffen.
A highly sensitive, quantitative, multiplexed and no-wash immunoassay for point-of-care-testing (POCT) was developed. The optical readout is based on surface-enhanced Raman scattering (SERS) as an ultrasensitive vibrational spectroscopic technique. Key components of the assay are very bright and photo-stable SERS nanotags consisting of noble metal nanoparticles and Raman-active reporter molecules on their surface in combination with a portable Raman reader. Single-particle SERS experiments demonstrate the high brightness of gold nanostars and gold/gold core/satellite particles. The experimental results are in good agreement with theoretical predictions from FEM-based electromagnetic computer simulations, which yield the corresponding local electric field enhancements.
Widely used labels in lateral flow assays (LFA) such as quasi-spherical gold nanoparticles, fluorescent dyes or colored polymer beads only allow a visual, i.e., qualitative yes/no answer or, in combination with a POC reader, a semiquantitative readout. Multiplexing is difficult and, if possible at all, only achievable with several spatially separated test lines on the membrane.
The SERS nanoparticles used in this work were successfully implemented into existing LFA technology. Comparable visual readout results with complex samples, such as a clinical serum sample, could be achieved. In addition, the limit of detection was significantly decreased via the SERS readout: a 15-fold improvement for the clinical sample and a 100-fold improvement for a purified system containing multiple tumor markers. The multiplexing capability was shown for two proinflammatory cytokines by using SERS nanotags with two different Raman reporter molecules exhibiting distinct spectral Raman signatures. This enabled the sequential detection of the cytokines on spatially separated test zones as well as their simultaneous detection at the same test zone.
A portable, inhouse-developed SERS reader with line focus illumination was used for the fast readout of the whole test line within only 5 seconds. This is a great improvement over all previously shown SERS-based lateral flow assays using conventional, expensive and non-portable Raman microscopes, since the readout time was reduced by at least 2-3 orders of magnitude.
The SERS technology therefore overcomes the current limitations of LFA technology by providing high sensitivity (e.g., for early cancer/ desease detection), quantification (so far only semiquantitative) and multiplexing for the simultaneous detection (time and cost saving) in combination with short readout time (portable SERS reader). Due to the universality of the presented SERS-LFA method it can also be used in other application areas ranging, e.g., from food analysis to the detection of drugs and biowarfare agents.