Analysis of the functions of the AAA-ATPase p97 in DNA double-strand break repair
Ionizing radiation (IR) can cause DNA double-strand breaks (DSBs) in the cellular genome, which result in genomic instability, if left unrepaired. The two major repair pathways to cope with DSBs are non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR). DSB repair by NHEJ is initiated by the Ku heterodimer that binds the open DNA ends and recruits all factors needed for ligation to the break. Each subunit of the Ku molecule fully encircles the DNA
and is therefore trapped by ligation of the DSB. To restore the DNA integrity, Ku needs to be actively removed after successful repair by NHEJ. In addition, it was claimed that Ku blocks end resection and therefore needs to be removed from open DNA ends to enable HRR. If a DSB is repaired by HRR, the 5’ ends are extensively resected and the single-stranded DNA regions are covered by RPA. The DNA-bound RPA can be phosphorylated by DNA-PK, before it is replaced
by Rad51 filaments. The Rad51 filaments mediate the search for the homologous sister chromatid for template-based repair.
In this study, clear evidence was found for p97 removing sterically trapped Ku80 from the DNA after successful DSB repair by NHEJ in human cells. Inhibition or depletion of the AAA+-ATPase p97 significantly delays the removal of Ku80 from the DNA after IR. Together with data from pulsed-field gel-electrophoresis and in vitro studies, this data demonstrates that p97 removes Ku from the DNA after successful ligation of the break. Furthermore, co-depletion of the p97 adapter
proteins Ufd1 and FAF1 exhibited a synergistic effect on Ku removal from the DNA.
In contrast, this study reveals that p97 inhibition blocks end resection after CPT treatment but not after IR. These data implicate that Ku removal from DNA by p97 is not required for proper end resection. Nevertheless, upon IR, p97 was found to act at the step of Rad51 filament formation during HRR. After IR, the formation of Rad51 filaments was reduced by p97 inhibition or depletion,
but notably not the preceding steps of RPA filament formation or RPA phosphorylation. In line with p97 targeting ubiquitinated substrates, ubiquitination by RNF8 promotes Rad51 filament formation
as well. However, at single-ended DSBs induced by treatment with the topoisomerase I inhibitor camptothecin (CPT), both end resection and RPA phosphorylation were reduced upon inhibition of p97. These data demonstrate an involvement of p97 in HRR that is distinct from its role in Ku
removal from the DNA. During HRR, p97 acts at the step of Rad51 filament formation as well as in early steps of DSB repair specifically after damage induction by CPT treatment.
In summary, the data presented in this study contribute to the overall understanding of DNA DSB repair mechanisms in human cells. Furthermore, these data establish Ku80 as novel p97 target and p97 as important factor to prevent genomic instability after DNA damage.
Ionisierende Strahlung (engl.: ionizing radiation, IR) kann zu DNS Doppelstrangbrüchen (DSBs) führen, die in genomischer Instabilität resultieren, wenn sie nicht repariert werden. Die zwei Hauptreparaturwege für den Umgang mit DSBs sind die nicht-homologe Endverknüpfung (engl.: non-homologous end-joining, NHEJ) und die homologe Rekombinationsreparatur (HRR). DSB-Reparatur durch NHEJ wird durch den Ku-Heterodimer eingeleitet, der offene DNS-Enden bindet und alle Faktoren rekrutiert, die für die Ligation des Bruchs benötigt
werden. Jede Untereinheit des Ku-Moleküls umschließt komplett die DNS und wird daher durch die Ligation des DSBs an der DNS fixiert. Um die Unversehrtheit der DNS wiederherzustellen, muss Ku nach erfolgreicher Reparatur durch NHEJ aktiv entfernt werden.
Außerdem wurde behauptet, dass Ku die Endresektion blockiert und daher von offenen DNSEnden entfernt werden muss, um HRR zu ermöglichen. Wenn ein DSB durch HRR repariert wird, werden die 5‘-Enden umfangreich resektiert und die einzelsträngigen DNS-Regionen werden von RPA gebunden. Das DNS-gebundene RPA kann von DNA-PK phosphoryliert werden, bevor es durch Rad51-Filamente ersetzt wird. Die Rad51-Filamente vermitteln die
Suche nach dem homologen Schwesterchromatid für die Homologie-basierte Reparatur.
In dieser Studie wurden klare Beweise gefunden, dass p97 in humanen Zellen das sterisch fixierte Ku80 nach der erfolgreichen DSB-Reparatur durch NHEJ von der DNS entfernt.
Inhibierung oder Depletion der AAA+-ATPase p97 verzögert signifikant die Entfernung von Ku80 von der DNS nach IR. Zusammen mit Daten aus einer Pulsfeld-Gelelektrophorese und in-vitro-Experimenten zeigen diese Daten, dass p97 Ku nach der erfolgreichen Ligation des DSBs von der DNS entfernt. Weiterhin zeigte eine Kodepletion von den p97 Adapterproteinen
Ufd1 und FAF1 einen synergistischen Effekt auf die Ku-Entfernung von der DNS.
In Gegensatz dazu zeigte diese Studie, dass die Inhibierung von p97 die Endresektion nach CPT-Behandlung blockiert, aber nicht nach IR. Diese Daten implizieren, dass die Ku-Entfernung von der DNS durch p97 nicht für korrekte Endresektion benötigt wird.
Nichtsdestotrotz wurde herausgefunden, dass p97 nach IR an dem Schritt der Rad51-Filamentbildung tätig ist. Nach IR war die Bildung von Rad51-Filamenten durch p97 Inhibierung oder Depletion reduziert, aber bemerkenswerterweise nicht die vorrangehenden Schritte der RPA-Filamentbildung oder RPA-Phosphorylierung. In Übereinstimmung damit,
dass p97 ubiquitinierte Substrate erkennt, förderte die Ubiquitinierung durch RNF8 ebenfalls Rad51-Filamentbildung. An einzel-endigen DSBs hingegen, die durch Behandlung mit Camptothecin (CPT) induziert wurden, einem Inhibitor gegen Topoisomerase I, waren sowohl Endresektion als auch RPA-Phosphorylierung durch p97-Inhibierung reduziert. Diese Daten
zeigen eine Beteiligung von p97 an HRR, die unabhängig von dessen Funktion bei der Ku-Entfernung von der DNS ist. Während HRR ist p97 sowohl an dem Schritt der Rad51-Filamentbildung tätig als auch in frühen Schritten der DSB-Reparatur spezifisch nach Schadensinduktion durch CPT-Behandlung.
Zusammenfassend tragen die Daten, die in dieser Studie präsentiert wurden, dazu bei, die DSB-Reparaturmechanismen in humanen Zellen zu verstehen. Weiterhin etablieren diese Daten Ku80 als neues Substrat von p97 und p97 als wichtigen Faktor um genomische Instabilität nach DNS Schäden zu verhindern.