1. Zusammenfassungen der Projekte Die Zusammenfassung der einzelnen Projekte dieser Arbeit wird, wie auch bei der Darstellung der Ziele, in drei Unterkapiteln erfolgen. 1.1. SARS CoV Mpro – Design eines potentiellen Dimerisierungsinhibitoren Ziel dieses Projektes war es, einen Weg zur Hemmung der SARS CoV Mpro aufzuzeigen, welcher über die Unterdrückung der für die Enzymaktivität essentiellen Dimerisierung der Protease wirkt. Die Analyse der Dimerisierungsfläche erfolgte optisch und mithilfe des Programms AutoLigand, wodurch ein klar abgegrenztes Volumen für das Ligandendesign definiert werden konnte. Für die rationale Entwicklung möglicher Liganden wurden Oberflächenmerkmale innerhalb der Dimerisierungsfläche identifiziert, welche durch einen geeigneten Binder adressiert werden können. Als zentraler Angriffspunkt eines potentiellen Dimerisierungsinhibitors wurde Arg 4 der Mpro herausgestellt, da es durch seine exponierte Position sowie die es umgebene Topographie, leicht zu erreichen scheint. Außerdem stellt Arg 4 eine für die Dimerisierung benötigte Aminosäure dar. Arginin kann an sich gut durch Guanidin-Rezeptoren adressiert werden, im Falle des Arg 4 liegt die Seitengruppe zudem exponiert, wodurch im Umfeld ausreichend Raum für eine Rezeptoreinheit besteht. Als Guanidin-Rezeptor wurde die von Schrader entwickelte Bisphosphonat-Pinzette (BP) ausgewählt, da sie relativ klein ist und sich ihre Ladung durch Methylveresterung der Phosphonat-Gruppen in einem Bereich von 0 bis 4 einstellen lässt. Neben der BP wurden weitere Fragmente gesucht, welche eine dem Arg 4 benachbarte aromatische Tasche besetzen können. Angestrebt wurde außerdem eine Art Oberflächenmimikry, welche die das Arg 4 umgebende unpolare, muldenförmige Topographie nachahmt, um so die Bindung und Lage des zu designenden Liganden stabilisieren zu können. Hierzu wurden in einem ersten kombinatorischen Schritt die aromatischen Aminosäuren His, Phe und Trp über Gly oder N-Ala als Linker an die unterschiedlich geladene BP angebracht und an der definierten Bindungsstelle durch Docking und Clusteranalyse untersucht. Hierbei stellte sich die Kombination BP(OMe)-Gly-Phe als günstig heraus, da sie den konzeptionellen Vorgaben des entwickelten Designs sehr gut entsprach. Sie zeigte, dass die BP-Gruppe das Arg 4 komplexiert, wobei gleichzeitig der Phenylring des Phe in der aromatischen Tasche bindet und der C-Terminus dieses kleinen Semipeptids dem Lösungsmittel zugewandt war, wodurch eine Weiterentwicklung des Liganden ohne Veränderung der Pose realisiert wurde. (Vgl. Abbildung 15, S. 37) Diese wurde dann, ausgehend von der im ersten Schritt des Designs gefundenen Struktur, durch Variation des Linkers und der Erweiterung der Struktur um eine GuaCbz- beziehungsweise OBn-Einheit als Oberflächenmimikry derivatisiert und die sich ergebene Gruppe von Konzeptliganden erneut durch Dockingtechniken untersucht. Der Ligand BP Phe GuaCbz stellte sich als günstigster Kandidat heraus, da er weiterhin Arg 4 über die BP-Einheit komplexiert, Phe in der aromatischen Tasche bindet und sich die GuaCbz-Gruppe dicht an die benachbarte, muldenförmige Oberfläche anschmiegt. Die so von dem Konzeptliganden eingenommene Konformation stabilisiert sich über zwei intramolekulare Wasserstoffbrücken und erreicht zudem in der virtuellen Studie sehr gute Dockingscores. Zur Einschätzung des gewünschten Einflusses auf die Dimerisierung der Mpro wurde der Dockingscore am Monomer der Protease (-9.13 kcal/mol, entspricht ΔGBind) rechnerisch mit ihrer Dimerisierungskonstante (100 μM, ergibt ein ΔGBind von 5.37 kcal/mol) verglichen. Aus diesem mathematischen Vergleich ergibt sich, dass der designte Ligand besser an der monomeren Mpro bindet als die Protease an sich selbst. Es kann davon ausgegangen werden, dass es möglich sein sollte, die Dimerisierung durch den Liganden BP-Phe-GuaCbz zu unterdrücken. (Vgl. Abbildung 48) Die in diesem Projekt angewandte Technik des de novo Designs eines neuen Liganden für eine ebenfalls neue Bindungsstelle ist vielseitig anwendbar. Die enzymatische Aktivität einer essentiellen Protease eines pathogenen Erregers mechanistisch, über die Hinderung der Aggregation des Enzyms, zu inhibieren, ist ein elegantes und erfolgsversprechendes Beispiel dieser Technik. 1.2. β-Tryptase – Evolution eines Bindungsmodells Die Weiterentwicklung eines bestehenden Bindungsmodells für Inhibitoren der β-Tryptase zur Adaption neuer experimenteller Befunde war das Ziel des zweiten Projekts dieser Arbeit. Das bisherige Modell zeigte eine Möglichkeit des Hemmmechanismus für vierarmige Liganden, welche durch Bindung an Aminosäuren am Eingang der zentralen Pore der Protease diese verschlossen. Hierdurch wurde das Eintreten eines potentiellen Substrates verhindert, wodurch es nicht zu den aktiven Zentren des Enzyms vordringen konnte und somit dessen Katalyse inhibiert wurde. Dieses Modell konnte jedoch nicht die unterschiedliche Hemmung der β-Tryptase durch zwei sequenzisomere, dreiarmige Substanzen (82, Ki = 22,5 nM und 96, Ki =114 nM, siehe Abbildung 20, S. 47) erklären, da diese ebenfalls auf analoge Weise die zentrale Pore versperren könnten. Die Analyse der vorliegenden Daten zeigte auf, dass diese dreiarmigen Inhibitoren nicht-kompetitiv wirkten. Eine von Heider durchgeführte virtuelle Untersuchung des Inneren der Pore deckte weitere Bindungsstellen im Umfeld der aktiven Zentren und nahe der Oligomerisierungsflächen der tetrameren Protease auf. Diese Informationen sollten zusammen mit den Erkenntnissen über die Hemmwirkung der beiden Isomere in das neue Modell einfließen. (Siehe Abbildung 49) Da die beiden Strukturen 82 und 96 relativ groß und sehr flexibel waren, mussten sie vor der Anwendung der Software Glide in kleinere Systeme zerlegt werden. Zu diesem Zweck wurden die Liganden von zwei ihrer drei Arme befreit. Die so entstandenen einarmigen Modellverbindungen wurden dann sukzessive an der inneren Porenoberfläche gedockt. Hierzu wurden drei Enclosing Boxes so positioniert, dass sie zum einen die Aminosäuren am Eingang der Pore und zum anderen die von Heider identifizierten neuen Bindungsstellen im Inneren der Pore abdeckten. Jede der drei Boxen deckte mehr als ein Drittel des zu untersuchenden Bereichs ab, womit auch die Grenzflächen zwischen den Boxen ausreichend berücksichtigt wurden. Während der Analyse möglicher Posen der Modellverbindungen musste der nicht-kompetitive Hemm- mechanismus berücksichtigt werden. Hierzu wurden die Berechnungen der Maps innerhalb der Boxen so gesteuert, dass die Liganden nicht direkt an den aktiven Zentren binden konnten. Das Docking der Modellverbindungen erfolgte, indem der Phenylring der Verbindungen mittig in der Pore gehalten wurde. Auf diese Weise konnte der Arm während der Docking-Läufe die innere Porenoberfläche abtasten. Durch den mittig positionierten Phenylring wurde die spätere Kombination der einzelnen Modellsysteme zu den vollständigen Liganden erleichtert. Die mithilfe dieser Methode generierten Posen wurden zunächst nach ihren Dockingscores sortiert, worauf die besten Posen der Modellverbindungen eines Liganden auf ihre Kombinierbarkeit optisch geprüft wurden. Nach der Identifizierung günstiger und kombinierbarer Posen wurden diese unter Zuhilfenahme der Sculpting-Technik an ihren Phenylringen zur Deckung gebracht und zu den vollständigen Inhibitoren kombiniert. Durch diesen manuellen Eingriff ist es notwendig im Anschluss an diese Kombination der Modellverbindungen die entstandene Pose einer Konformationsanalyse zu unterwerfen, um die Stabilität der Pose und damit ihre Relevanz zu überprüfen. Auf diese Weise entstanden Posen von 82 und 96, welche anhand ihres gemittelten Dockingscores und des über die Konformationssuche eingeschätzten Unterschieds in ihrer Bindungsenergie verglichen wurden. Hierbei zeigten die Rechnungen für den Liganden 82 im Vergleich zu 96 einen um 1 kcal/mol besseren Score auf, jedoch eine um ca. 12 kcal/mol ungünstigere Bindungsenergie. Der rein energetische Vergleich der beiden Posen konnte demnach nicht als Rechtfertigung für die um einen Faktor von 5 bessere Hemmstärke von 82 dienen, woraufhin eine weitere optische Analyse der Lage und des Raumanspruchs der Liganden im Inneren der Pore erfolgte. Diese Betrachtung nahm die SASA als Maßstab für den Platzbedarf der Inhibitoren. Es zeigte sich, dass 82 durch seine die Pore durchspannende Konformation, selbige nahezu vollständig blockiert, wohingegen 96 nur einen Teil versperrt. (Vgl. unterschiedliche Ausdehnung der Liganden 82 und 96 in Abbildung 49, rechts) Diese Information über den sterischen Anspruch der Liganden im Inneren der β Tryptase und die daraus resultierende teilweise, beziehungsweise vollständige Besetzung der Pore konnte als Begründung des Unterschieds in der Hemmwirkung der Isomere herangezogen werden. Die Realisierung der Simulation der sehr flexiblen Liganden durch die selbst entwickelte Technik des sukzessiven Dockings, unter Berücksichtigung bestehender experimenteller Befunde, konnte somit erfolgreich ein neues, die Eigenschaften dieser beiden Liganden erklärendes Bindungsmodell generieren. 1.3. 14-3-3 – Ligandendesign durch virtuelle Retrosynthese Das letzte in dieser Arbeit beschriebene Projekt fokussierte auf der Entwicklung eines Liganden für die Dimerisierungsfläche der 14-3-3ζ Adapterproteins. Da sich bislang in der Literatur keine Beispiele für Binder der Dimerisierungsfläche finden, wurde als Ausgangspunkt für die Generierung ein breit angelegtes UV/Vis-Screening genutzt, bei welchem 70 kationische Verbindungen gegen die ζ-Isoform getestet wurden. Eine der vielversprechendsten Verbindungen in dem Screening war 54. Von diesem initial gefundenen Liganden wurde durch retrosynthetische, dockingbasierte Analyse (vgl. Abbildung 36, S. 63) ein bindungsrelevantes Fragment identifiziert. Dieses Fragment wurde daraufhin durch Variation seiner Ladung derivatisiert. Das Derivat mit der günstigsten Pose und dem besten Score dieser Analyse war Verbindung 118. Die gefundene Pose an der Dimerisierungsfläche konnte durch ein Epitopsy nochmals bestätigt werden. Basierend auf diesen Simulationsergebnissen wurde der Ligand synthetisiert und seine Bindungseigenschaften über eine UV/Vis- und MST-Titration erhoben: KD = 530 nM, UV/Vis und KD = 662 nM, MST. Ein Job Plot ergab die Stöchiometrie von 1:1 des Komplexes zwischen 118 und dimerem 14-3-3ζ, wodurch sich das Ergebnis der zuvor durchgeführten Simulationen bestätigte. Die genaue Lage und Konformation des Liganden war von größtem Interesse, weshalb der Versuch der Kristallisation von 118 in seiner Bindung zum Protein durchgeführt wurde. Die Kristallisation verlief erfolgreich, jedoch bildete das Beugungsmuster der röntgenspektroskopischen Untersuchung des Kristalls den Liganden mit einer sehr geringen Auflösung ab. Deutlich zu erkennen war die Lage des Liganden inmitten der sich in der Dimerisierungsfläche bildenden Pore. Nicht abgebildet wurde seine genaue Konformation, sowie sein Protonierungsgrad. Zur Ermittlung des Protonierungsgrads des Liganden in gebundenem Zustand wurden die pKa-Werte der protonierbaren Gruppen von Grad mit dem Programm PROPKA ermittelt. Hieraus ergab sich für die GCP- und Lysin-Amino-Gruppe ein pKa-Wert von 6.4, wodurch anzunehmen ist, dass 118 im nicht-protonierten, also ungeladenen, Zustand bindet. Die Optimierung der Kristallstruktur erfolgte daraufhin durch QM/MM MD Simulationen, welche von Mittal durchgeführt wurden. Mithilfe dieser Optimierung und den Informationen über den Protonierungsgrad konnte ein sehr genaues Bild des Liganden zwischen den Monomeren des 14-3-3ζ Proteins erstellt werden. Den Studien zufolge bindet der Ligand an der Dimerisierungsoberfläche, die ermittelten Interaktionen des Liganden bilden sich hauptsächlich zwischen dessen Lysin und einem Monomer. Das andere Monomer wird derweil durch die GCP-Gruppe gebunden. In diesem Projekt wurde durch virtuelle Retrosynthese erfolgreich ein Ligand für eine biologisch relevante Position an 14-3-3ζ entwickelt, welche zuvor noch keine Beschreibung in der Literatur fand. Die Illustration in Abbildung 50 zeigt zusammenfassend den Verlauf des Ligandendesigns von dem initialen Fund bis zur optimierten Kristallstruktur. Die denkbaren Entwicklungsmöglichkeiten dieses Systems sind vielfältig und werden in zukünftigen Studien dazu beitragen, die Funktion und Steuerung dieser Proteinfamilie besser zu verstehen. Einige der Entwicklungs- und Analysemöglichkeiten zur Erhöhung der Spezifität zwischen den humanen Isoformen oder zur Modulation von Heterodimerisierung verschiedener Isoformen wurden in Kapitel 7.4 (ab S. 72) vorgestellt. Die zur fortschreitenden Entwicklung von 118 berechneten Derivate (118.1 - 118.11, Abbildung 47, S. 78) konnten durch die Ergebnisse der QM/MM MD Simulationen und durch Verwendung der Core-Funktion von Glide innerhalb der Pore und nahe der Konformation von 118 an 14-3-3ζ berechnet werden. Innerhalb dieser Derivate schnitten 118.4 - 118.7, welche zur Steigerung der Affinität zur ζ-Isoform generiert wurden, im Docking tatsächlich besser ab. Im Rahmen der Simulationen dieser zweiten Generation an Bindern der Dimerisierungsfläche der 14-3-3 Proteine konnten Indizien für eine mögliche Isoformspezifität ausgearbeitet werden. Diese können in weiterführenden Arbeiten an diesem Projekt zur Entwicklung spezifischer Liganden zur Adressierung der verschiedenen Isoformen und Dimerisierungsvarianten von Nutzen sein.