Biophysikalische und funktionelle Charakterisierung humaner Tyrosin-sulfatierter Peptide
Die Sulfatierung von Tyrosinen ist eine weit verbreitete post-translationale Modifikation, welche in den intrazellularen Transport sekretierter Peptide, in die Regulierung von extrazellulären Protein-Protein-Interaktionen, in die Regulierung verschiedenen Rezeptoren und in die Förderung proteolytischer Prozesse einiger Peptid-Hormone involviert ist. Innerhalb dieser Arbeit wurden mit dem N-Terminus des CCR5-Rezeptors und dem Speichel-Peptid Histatin1 zwei humane Vertreter Tyrosin-sulfatierter Peptide auf unterschiedliche Weise charakterisiert.
Als erstes sollten für eine Sequenz aus dem N-Terminus des CCR5 Rezeptors Binder mithilfe einer kombinatorischen Protein-Bibliothek identifiziert werden. Dazu wurde zunächst eine Bibliothek auf Basis der Phosphat-bindenden IRS1-PTB-Domäne entwickelt und das Ziel-Peptid CCR512-18 mittels Festphasen-Peptid-Synthese hergestellt. Für die Selektion bindender Mutanten wurde ein Ribosomen-Display etabliert. Die daraus hervorgehenden Mutanten wurden exprimiert und gereinigt sowie zur Bestimmung ihrer Bindungs-Affinität gegenüber der sulfatierten und der nicht-sulfatierten Variante des Ziel-Peptids in einem Fluoreszenz-Anisotropie-Assay untersucht. Dabei konnte eine Triple-Mutante der IRS1-PTB-Domäne identifiziert werden, welche zwischen dem Tyrosin-sulfatierten Peptid und der Kontrolle diskriminiert. Zudem zeigt ein mögliches Bindungs-Modell des sulfatierten CCR512-18 an die Mutante ein analoges Bindungsverhalten wie bei der gp120-Corezeptor-Bindung.
Als zweites sollte das im Gegensatz zu Histatin5 kaum untersuchte Histatin1 strukturell und funktionell charakterisiert werden. Dazu wurde dieses zunächst in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert und die Expression in E. coli sowie die zugehörige Reinigung etabliert. Anschließend wurde die dreidimensionale Struktur des Peptids in hydrophiler Umgebung aufgelöst. Diese beinhaltet drei definierte Helices, welche zwei mögliche Grenz-Konformationen zueinander einnehmen. Außerdem wurden sowohl die antifungale Aktivität als auch die Wundheilungs-Eigenschaften von Histatin1 unter Beachtung der funktionellen Domänen untersucht. So kam ein N terminales Fragment (Histatin14-15) in einem Toxizitäts-Assay gegen S. cerevisiae zum Einsatz und zeigte volle antifungale Aktivität gegenüber Histatin1 in voller Länge. Des Weiteren wurde ein Wundheilungs-Assay laborintern etabliert, mit welchem ein C terminales Fragment (Histatin120-32) als sulfatierte und nicht-sulfatierte Variante verglichen werden konnte. Dabei wurde ein aktivierender Effekt des sulfatierten Histatin120-32 nachgewiesen, welcher jedoch vermutlich auf die eingebrachte negative Ladung in der C-terminalen Helix zurückzuführen ist. Bei Übertragung der jeweils minimal aktiven Fragmente auf die Struktur, entspricht der für die antifungale Aktivität verantwortliche Bereich dem Gelenk zwischen Helix 1 und 2 und das für die Wundheilung zuständige Fragment dem Gelenk zwischen Helix 2 und 3.
Tyrosin sulfation is a widespread post-translational modification implicated in the intracellular trafficking of secreted peptides, in the modulation of extracellular protein-protein interactions, in the modulation of several receptors and in the promotion of proteolytic processing of some peptide hormones. Here with the N-terminal CCR5 receptor and the salivary peptide histatin 1 two representatives of human tyrosine sulfated peptides were characterised differently.
First, artificial binders should be identified for a sequence of the N-terminus of the CCR5 receptor using a combinatorial protein library. For that, a library based on the phosphate binding IRS1 PTB domain was developed and the target peptide CCR512-18 was prepared by solid phase peptide synthesis. For the selection of binding mutants a ribosome display was established. The resulting mutants were expressed, purified, and examined in a fluorescence anisotropy assay to determine their binding affinity with respect to the sulfated and non-sulfated variant of the target peptide. Thereof a triple mutant of IRS-1 PTB domain has been identified which discriminates between the tyrosine sulfated peptide and control. In addition, a potential binding model of sulfated CCR512-18 to the mutant indicates analogous binding behavior as the gp120 coreceptor binding.
Second, compared with histatin 5, histatin1 ist hardly examined. Thus it should be structurally and functionally characterized. For this purpose, it was cloned into a suitable expression vector and expression in E. coli as well as purification has been established. Subsequently, the threedimensional structure of the peptide was determined in hydrophilic environment. It includes three defined helices, which occupy two possible border conformations. Furthermore, both the antifungal activity and the wound-healing properties of histatin 1 in compliance with the functional domains have been investigated. An N-terminal fragment (histatin 14-15) was used in a toxicity assay against S. cerevisiae and showed full antifungal activity in comparison with full length histatin 1. A wound healing assay has been established in which a sulfated and non-sulfated variant of a C-terminal fragment (histatin 120-32) could be compared. An activating effect of the sulfated histatin 120-32 was detected, which is, however, probably due to the negative charge introduced in the C-terminal helix. Mapping the N- and C- terminal minimal activity fragment onto the peptide structure, the antifungal activity corresponds to the joint between helix 1 and 2 and the wound healing fragment matches to the joint between helix 2 and 3.
Vorschau
Zitieren
Zitierform:
Zitierform konnte nicht geladen werden.