Effects of preovulatory aging on the developmental competence of mouse oocytes
Preovulatory aging of oocytes is caused by a delay in ovulation and it is known to impair postimplantation embryonic development. However, hardly anything is known about the molecular mechanisms associated with preovulatory aging. To investigate several aspects of RNA dynamics in the preovulatory-aged oocytes and possible consequences on early preimplantation development, the present study used a mouse model in which ovulation was postponed with the GnRH antagonist cetrorelix.
Preovulatory aging led to a lower number of ovulated oocytes. Furthermore, preovulatory-aged oocytes were more difficult to fertilize, as was demonstrated by a decrease in 2-cell embryo rate after mating compared to controls. These results are in accordance with previous studies on preovulatory aging in several vertebrate models including rats and humans.
As an indicator for transcriptional silencing and genome stability during oocyte growth, the epigenetic histone modification H3K9 trimethylation was analyzed using immunofluorescence. No effect of preovulatory aging on H3K9 trimethylation levels was observed. Before transcriptional silencing, mRNAs are stored in the oocyte until recruitment for protein translation later during oocyte maturation. One major key player in the storage and recruitment of maternal transcripts is the RNA-binding protein Ybx2. Immunofluorescent staining showed a significant decrease in Ybx2 protein abundance after preovulatory aging, which might have severe implications for RNA dynamics in the oocyte.
Since the RNA-storage potential seemed impaired, transcript levels of selected maternal effect genes were analyzed by qRT-PCR. Maternal effect genes are of crucial importance for oocyte developmental potential because they function in the early embryo before transcription initiates again. Transcript levels of 2 out of 10 investigated ME genes (Smarca4 and Tet3) decreased significantly after preovulatory aging. Additionally, oligo(dT) priming allowed investigation of poly(A) tail length of mRNAs of the candidate maternal effect genes by qRT-PCR. The poly(A) tail determines the translation efficiency of transcripts in the oocyte and early embryo. The majority of genes showed elongation of poly(A) tail length after preovulatory aging. Similar results were also found after in vitro preovulatory aging of oocytes grown in follicle culture, although not the same genes were affected than in vivo.
Loss of Ybx2 protein and polyadenylation of maternal effect gene transcripts should occur later during oocyte maturation. Therefore, the results imply premature recruitment of mRNAs for protein translation. This assumption is supported by experiments determining the start of transcription at the 2-cell stage of embryonic preimplantation development in the course of embryonic genome activation. Embryos were incubated in BrUTP, which intercalates into nascent RNA and can by visualized by immunofluorescence. Compared to controls, in embryos derived from preovulatory-aged oocytes an increase in transcription was observed, indicating a precocious start of embryonic genome activation.
Last, DNA methylation maintenance of three imprinted genes (H19, Snrpn, Igf2r) during epigenetic reprogramming in the preimplantation embryo was analyzed. Deep amplicon bisulfite sequencing of single 8-cell embryos showed stable maintenance of DNA methylation at the investigated loci.
Overall, the results show that the investigated processes are distinctly regulated in the oocyte and early embryo and not all of them are susceptible to preovulatory aging. Nevertheless, preovulatory aging impairs oocyte quality with possible long-term effects on embryonic development and reproductive success.
Eine Verzögerung des Eisprungs führt zu präovulatorischer Überreife der Oozyte und dies kann die Entwicklung des Embryos nach der Einnistung in die Gebärmutter beeinträchtigen. Über die molekularen Mechanismen, die das Entwicklungspotenzial der überreifen Oozyte beeinflussen und die Auswirkungen auf die frühe Embryonalentwicklung ist nur wenig bekannt. Mit Hilfe eines Mausmodells, in dem der Eisprung mit Hilfe des GnRH Antagonisten Cetrorelix hinausgezögert wurde, wurden in dieser Studie verschiedene Aspekte der RNA Dynamik in der überreifen Oozyte und mögliche Konsequenzen für die frühe Embryonalentwicklung vor der Einnistung untersucht.
Die Verzögerung des Eisprungs führte zu einer verringerten Anzahl von ovulierten, reifen Oozyten. Außerdem ließen sich überreife Oozyten schlechter befruchten, was zu einer Abnahme der Zahl von 2-Zell-Embryonen nach Verpaarung führte. Diese Ergebnisse stimmen mit vorhergegangenen Studien zur präovulatorischen Überreife in verschiedenen Vertebraten, u.a. Ratten und Menschen, überein.
Während des Oozyten-Wachstums wird die Transkription eingestellt. Dieser Prozess wurde mittels Immunofluoreszenz gegen die epigenetische Histonmodifikation H3K9-Trimethylierung untersucht. Dabei wurde kein Effekt der präovulatorischen Überreife auf das Ausmaß der H3K9-Trimethylierung beobachtet. Vor dem transkriptionellen Arrest werden mRNAs in der Oozyte gespeichert, bis sie im späteren Verlauf der Oozyten-Reifung für die Translation von Proteinen rekrutiert werden. Ein wichtiger Faktor für die Speicherung und Rekrutierung von mRNA in der Oozyte ist das RNA-Bindeprotein Ybx2. Mittels Immunofluoreszenz konnte eine signifikante Abnahme der Ybx2 Proteinmenge nach präovulatorischer Überreife gezeigt werden. Dies könnte zu Störungen der RNA-Speicherung in der Oozyte führen. Um dies zu ermitteln wurde die Transkriptmenge von ausgewählten maternalen Effektgenen (ME-Genen) mittels qRT-PCR untersucht. Transkripte der ME-Gene sind entscheidend für das Entwicklungspotential der Oozyte, da sie im frühen Embryo, dessen Transkription noch nicht begonnen hat, wirken. Von zwei der 10 untersuchten ME-Gene (Smarca4 und Tet3) waren die Transkriptmengen, im Vergleich zu den Kontrollen, in überreifen Oozyten signifikant reduziert. Außerdem wurde die Poly(A)-Schwanzlänge von ME-Genen untersucht, da diese die Effizienz der Translation eines Transkriptes in der Oozyte bestimmt. In überreifen Oozyten zeigte der Großteil der analysierten Kandidatengene eine Verlängerung des Poly(A)-Schwanzes. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei in vitro präovulatorisch überreifen Oozyten aus einer Follikelkultur beobachtet, obwohl hier nicht die gleichen ME-Gene beeinträchtigt waren.
Die beobachtete Abnahme von Ybx2-Protein und die Verlängerung des Poly(A)-Schwanzes der ME-Transkripte sind Prozesse, die während der Eizell-Reifung eigentlich später stattfinden. Die Beobachtung, dass diese Prozesse bei präovulatorischer Alterung früher stattfinden, impliziert, dass auch die Rekrutierung von mRNA für die Proteintranslation verfrüht stattfinden könnte, was die Transkription im Embryo beeinflussen kann. Diese Annahme wird durch Analysen zur Aktivierung der Transkription im 2-Zell-Embryo unterstützt. Embryonen wurden in BrUTP inkubiert, welches sich während der Transkription in die RNA einlagert und mit Immunofluoreszenz nachgewiesen werden kann. Dieses Experiment zeigte, im Vergleich zu Kontrollen, eine Zunahme der Transkription in Embryonen von überreifen Oozyten, was auf einen vorzeitigen Start der embryonalen Genomaktivierung hindeutet.
Zuletzt wurde die DNA-Methylierung von drei Genen, die dem Imprinting unterliegen (H19, Snrpn, Igf2r), in einzelnen 8-Zell-Embryonen analysiert. Deep amplicon bisulifte sequencing zeigte einen stabilen Erhalt der DNA-Methylierung nach präovulatorischer Überreife in den untersuchten Loci.
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die untersuchten Prozesse in der Oozyte und im frühen Embryo individuell reguliert sind und nicht alle durch präovulatorische Überreife gestört werden. Dennoch lässt sich sagen, dass präovulatorische Überreife die Qualität der Oozyte beeinträchtigt, mit möglichen Langzeiteffekten auf die Embryo-Entwicklung und den Reproduktionserfolg.
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